Cultivo de Células progenitoras neurales en un hidrogel de péptidos 3-dimensional de auto-montaje

Summary

A continuación se describe el uso de un auto-montaje de andamios de 3 dimensiones para cultivo de células progenitoras neurales humanas. Se presenta un protocolo para liberar las células de los andamios para ser analizados posteriormente por ejemplo, mediante citometría de flujo. Este protocolo puede ser adaptado a otros tipos de células para llevar a cabo estudios detallados de manera mecánica.

Abstract

La influencia de tres dimensiones (3D) los andamios en la diferenciación de crecimiento, la proliferación neuronal y por último es de gran interés con el fin de encontrar nuevos métodos de terapias basadas en células y estandarizada en las enfermedades neurológicas o enfermedades neurodegenerativas. Estructuras 3D se espera que proporcionen un ambiente mucho más cercano a la situación in vivo de las culturas en 2D. En el contexto de la medicina regenerativa, la combinación de biomateriales con madre neurales y las células progenitoras es una gran promesa como una herramienta terapéutica. ^1.5 Los sistemas de cultivo que simula un entorno tridimensional se ha demostrado que influyen en la proliferación y diferenciación en diversos tipos de células madre y las células progenitoras. En esto, la formación y funcionalización de la 3D-microenviroment es importante para determinar la supervivencia y el destino de las células incrustado. ^6-8 Aquí usamos PuraMatrix ^9,10 (RADA16, PM), un péptido de hidrogel a base de andamios,que está bien descrito y utilizado para estudiar la influencia de un entorno 3D en diferentes tipos celulares. ^7,11-14 PuraMatrix se pueden personalizar fácilmente y la fabricación sintética de la nano-fibras proporciona un sistema de cultivo en 3D de alta fiabilidad, que es, además de xeno-libre.

Recientemente se ha estudiado la influencia de la concentración de PM-en la formación del andamio. ¹³ En este estudio las concentraciones utilizadas de PM tuvo un impacto directo sobre la formación de la estructura 3D, que fue demostrado por microscopía de fuerza atómica. Un posterior análisis de la supervivencia y la diferenciación de la hNPCs reveló una influencia de las concentraciones utilizadas de PM en el destino de las células incrustado. Sin embargo, el análisis de la supervivencia o la diferenciación neuronal por medio de técnicas de inmunofluorescencia poseen algunos obstáculos. Para obtener datos fiables, hay que determinar el número total de células en una matriz para obtener el número relativo de ejemplo. células neuronales marcados por βIII-tubulina. Este pre-requisitos de una técnica para analizar los andamios en todas las dimensiones de 3 por un microscopio confocal o una técnica comparable como los microscopios de fluorescencia capaces de tomar z-pilas de la muestra. Además, este tipo de análisis es extremadamente lento.

Aquí se demuestra un método para liberar las células de los andamios en 3D-por ejemplo, para el posterior análisis por citometría de flujo. En este protocolo las células progenitoras neurales (hNPCs) de la línea celular ReNcell VM (Millipore EE.UU.) se cultivaron y se diferencian en 3D andamios que consiste en PuraMatrix (PM) o PuraMatrix complementado con la laminina (PML). En nuestras manos un PM-concentración de 0,25% fue óptimo para el cultivo de las ¹³ células, sin embargo, la concentración puede ser adaptado a otros tipos de células. ¹² Las células liberadas pueden ser utilizados para, por ejemplo estudios inmunocitoquímicos y posteriormente analizados por citometría de flujo. Esto acelera el análisis y la movolver otra vez, el resto de datos obtenidos sobre una base más amplia, la mejora de la fiabilidad de los datos.

Protocol

1. Parte 1: Cultura de hNPCs en PuraMatrix De antelación a la generación de un andamio con una concentración de 0,25% PuraMatrix sin laminina que se necesita para preparar las siguientes soluciones Prepare una solución de sacarosa al 20% y una solución que contenga 10% de sacarosa disuelta en agua destilada estéril. Para la solución de una mezcla de 120 l de la solución de sacarosa al 20% con 120 l de agua destilada en un tubo de 1,5 ml cónico. Para la solución de dos m…

Discussion

El uso de andamios 3D ofrece la oportunidad de estudiar el desarrollo de diferentes tipos de células en una situación de cultivo celular más cercana a la situación in vivo. Sin embargo, en relación con el análisis de la diferenciación neuronal por ejemplo, o estudios funcionales que uno tiene que superar algunos obstáculos para obtener datos fiables para la cuantificación por ejemplo, de tipos de células.

Aquí se describe la cultura de hNPCs en el hidrogel basado…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
PuraMatrix peptide hydrogel	BD Bioscience	354250
Mouse laminin I	Cultrex	400-2009090
Sucrose	Sigma	S9378-1KG
Normal goat serum	Dako	X0907
Triton X 100	Roth	3051.3
PBS Dulbecco	Biochrom AG	L 1825
HBSS	Gibco	14170-088	Hanks’ Balanced Salt Solution 1X
βIII-tubulin antibody	Santa Cruz	Sc-51670	Mouse, monoclonal, 1:500
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A 11029	Goat α mouse, 1:1000
Alexa Fluor 568	Invitrogen	A 11031	Goat α mouse, 1:1000
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A 21235	Goat α mouse, 1:1000
Mowiol 4-88 Reagent	Calbiochem	475904
Dabco	Aldrich	D2,780-2	1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane 98%
Cell strainer	BD Biosciences	352350	70 μm pore size
Saponin	Merck	7695
Trypsin/ EDTA	GIBCO	25300-054
Benzonase 250 U/μl	Merck	1.01654.0001
Trypsin Inhibitor	Sigma	T6522 (500 mg)
20% HSA	Octapharma	Human-Albumin Kabi 20%