Kultivierung humaner neuronaler Vorläuferzellen in einer 3-dimensionalen Self-Montage Peptide Hydrogel
Summary
Hier beschreiben wir die Verwendung eines sich selbst organisierenden 3-dimensionalen Gerüst zur Kultur humaner neuraler Vorläuferzellen. Wir präsentieren ein Protokoll, um die Zellen aus dem Gerüste Freisetzung analysiert anschließend zB mittels Durchflusszytometrie werden. Dieses Protokoll kann zu anderen Zelltypen angepasst werden, um detaillierte mechanistisch Studien durchzuführen.
Abstract
Der Einfluss von 3-dimensionalen (3D) Gerüste auf Wachstum, Proliferation und schließlich neuronale Differenzierung ist von großem Interesse, um neue Methoden für die zellbasierte und standardisierte Therapien bei neurologischen Erkrankungen oder neurodegenerativen Erkrankungen zu finden. 3D-Strukturen sollen ein Umfeld viel näher liefern, um die in vivo Situation als 2D-Kulturen. Im Rahmen der regenerativen Medizin, hält die Kombination von Biomaterial Gerüste mit neuralen Stamm-und Vorläuferzellen großes Versprechen als therapeutisches Werkzeug. 1-5 Kultur-Systemen emuliert eine dreidimensionale Umgebung haben gezeigt, dass die Proliferation und Differenzierung in verschiedene Arten von Stammzellen beeinflussen und Vorläuferzellen. Hierbei wird die Bildung und Funktionalisierung der 3D-Mikroumgebung wichtig für das Überleben und das Schicksal der eingebetteten Zellen zu bestimmen. 6-8 Hier haben wir PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), ein Peptid Hydrogel Gerüst,die ist gut beschrieben und verwendet werden, um den Einfluss einer 3D-Umgebung auf verschiedenen Zelltypen zu untersuchen. 7,11-14 PuraMatrix kann leicht angepasst werden und das synthetische Herstellung der Nano-Fasern bietet eine 3D-Kultursystem von hoher Zuverlässigkeit, die wird zusätzlich xeno-frei.
Vor kurzem haben wir den Einfluss der PM-Konzentration auf die Bildung des Gerüstes untersucht. 13 In dieser Studie verwendeten Konzentrationen von PM hatten einen direkten Einfluss auf die Bildung der 3D-Struktur, die durch Rasterkraftmikroskopie nachgewiesen wurde. Eine anschließende Analyse der Überleben und die Differenzierung der hNPCs zeigte einen Einfluss der verwendeten Konzentrationen von PM auf das Schicksal der eingebetteten Zellen. Allerdings zeigt die Analyse des Überlebens oder der neuronalen Differenzierung durch Immunfluoreszenztechniken besitzen einige Hürden. Um sich verlässliche Daten, muss man die Gesamtzahl der Zellen in einer Matrix zu bestimmen, um die relative Anzahl von z. B. erhalten. neuronalen Zellen durch βIII-Tubulin markiert. Diese Voraussetzungen eine Technik, um die Gerüste in allen 3-Dimensionen mit einem konfokalen Mikroskop oder eine vergleichbare Technik wie Fluoreszenz-Mikroskope in der Lage, Z-Stapel von der Probe zu analysieren. Des Weiteren wird diese Art der Analyse ist extrem zeitaufwendig.
Hier zeigen wir eine Methode, um Zellen aus dem 3D-Gerüste für die spätere Analyse zB mittels Durchflusszytometrie freizugeben. In diesem Protokoll menschliche neurale Vorläuferzellen (hNPCs) der ReNcell VM-Zelllinie (Millipore USA) wurden kultiviert und differenziert in 3D-Gerüsten aus PuraMatrix (PM) oder PuraMatrix mit Laminin (PML) ergänzt. In unseren Händen ein PM-Konzentration von 0,25% war optimal für die Kultivierung der Zellen 13, aber die Konzentration auf andere Zelltypen können angepasst werden. 12 Die freigesetzten Zellen können zB immunzytochemische Studien eingesetzt werden und anschließend mittels Durchflusszytometrie analysiert. Dies beschleunigt die Analyse und more über die gewonnenen Daten beruhen auf einer breiteren Basis, die Verbesserung der Zuverlässigkeit der Daten.
Protocol
Discussion
Der Einsatz von 3D-Gerüsten bietet die Möglichkeit, die Entwicklung verschiedener Zelltypen in einer Zellkultur Situation näher an die in vivo Situation zu studieren. Doch in Bezug auf die Analyse von zB neuronale Differenzierung oder funktionelle Untersuchungen muss man einige Hürden überwinden, um zuverlässige Daten für zB Quantifizierung von Zelltypen zu gewinnen.
Hier beschreiben wir die Kultur des hNPCs in der Peptid-Hydrogel-basierte Gerüst PuraMatrix und anschließend…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Norman Krüger für seine ausgezeichneten technischen Support danken.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| PuraMatrix peptide hydrogel | BD Bioscience | 354250 | |
| Mouse laminin I | Cultrex | 400-2009090 | |
| Sucrose | Sigma | S9378-1KG | |
| Normal goat serum | Dako | X0907 | |
| Triton X 100 | Roth | 3051.3 | |
| PBS Dulbecco | Biochrom AG | L 1825 | |
| HBSS | Gibco | 14170-088 | Hanks’ Balanced Salt Solution 1X |
| βIII-tubulin antibody | Santa Cruz | Sc-51670 | Mouse, monoclonal, 1:500 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A 11029 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A 11031 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A 21235 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Aldrich | D2,780-2 | 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane 98% |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | 70 μm pore size |
| Saponin | Merck | 7695 | |
| Trypsin/ EDTA | GIBCO | 25300-054 | |
| Benzonase 250 U/μl | Merck | 1.01654.0001 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522 (500 mg) | |
| 20% HSA | Octapharma | Human-Albumin Kabi 20% |
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