मल्टी वर्णक्रमीय इमेजिंग फ्लो द्वारा नैनोकणों और जीवाणु के सेलुलर internalization का विश्लेषण
Summary
इस अनुच्छेद में, हम एक बहु – वर्णक्रमीय इमेजिंग प्रवाह cytometry का उपयोग करने के लिए रॉ 264.7 कोशिकाओं द्वारा polyanhydride नैनोकणों या बैक्टीरिया के internalization यों विधि का वर्णन.
Abstract
Nanoparticulate सिस्टम वैक्सीन वितरण में मूल्यवान उपकरण के रूप में उभरा है प्रतिजन पेश 1-5 कोशिकाओं उनके कुशलतापूर्वक प्रोटीन सहित माल देने की क्षमता के माध्यम से,. नैनोकणों के प्रतिजन कोशिकाओं द्वारा internalization (एन पी) एक प्रभावी समझाया प्रतिजन के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पैदा करने में एक महत्वपूर्ण कदम है. Nanoparticle निर्माण प्रभाव समारोह में कैसे परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए, हम एक उच्च throughput, मात्रात्मक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल है कि के रूप में अच्छी तरह से भली भाँति नैनोकणों बैक्टीरिया का पता लगाने के साथ संगत था विकसित करने की मांग की. तिथि करने के लिए, दो स्वतंत्र तकनीक, माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry, नैनोकणों के phagocytosis अध्ययन तरीकों का इस्तेमाल किया गया है. प्रवाह cytometry के उच्च throughput प्रकृति मजबूत सांख्यिकीय डेटा उत्पन्न करता है. हालांकि, कम संकल्प के कारण, यह करने के लिए सही सेल बाध्य नैनोकणों बनाम भाँति यों विफल रहता है. माइक्रोस्कोपी उच्च स्थानिक संकल्प के साथ छवियों को उत्पन्न करता है, जowever, यह समय लगता है और छोटा सा नमूना आकार 6-8 शामिल है. बहु – वर्णक्रमीय इमेजिंग प्रवाह cytometry (MIFC) एक नई तकनीक है कि दोनों माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry है कि एक लामिना कोर के माध्यम से बहु रंग वर्णक्रमीय प्रतिदीप्ति और चमकीले क्षेत्र इमेजिंग के साथ प्रदर्शन के पहलुओं को शामिल किया है. यह फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता और विभिन्न संरचनाओं और उच्च गति में सेलुलर सुविधाओं के बीच स्थानिक रिश्तों की एक सटीक विश्लेषण की क्षमता प्रदान करता है.
इस के साथ साथ, हम एक MIFC उपयोग करने के लिए सेल आबादियों कि polyanhydride नैनोकणों या साल्मोनेला enterica serovar ताकि के भाँति विशेषताएँ विधि का वर्णन करता है. हम भी nanoparticle के निलंबन, सेल लेबलिंग, एक ImageStream एक्स सिस्टम पर अधिग्रहण और डेटा का विश्लेषण और विचारों का आवेदन का उपयोग करने की तैयारी का वर्णन. हम भी internalization के पी अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक तकनीक के आवेदन का प्रदर्शननैनोकणों और बैक्टीरिया के लिए actin की मध्यस्थता phagocytosis की एक अवरोध करनेवाला के रूप में cytochalasin डी का उपयोग करके athways.
Protocol
Discussion
अध्ययनों से पता चला है कि biodegradable नैनोकणों पाली (लैक्टिक – सह – glycolic (PLGA) एसिड या polyanhydrides के आधार पर लक्ष्य कोशिकाओं को समझाया प्रतिजनों या दवाओं को वितरित किया जा सकता है इन नैनोकणों phagocytic कोशिकाओं द्वारा तेज उनक?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के लिए वित्तीय ONR – मूरी (NN00014-06-1-1176) पुरस्कार और अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान और materiel कमान (अनुदान नंबर W81XWH-09-1-०३८६ और W81XWH-10-1-0806) शुक्रिया अदा करना चाहूँगा समर्थन.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| RAW 264.7 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | TIB-71 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S 11150 | Premium Grade |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 24-well plate | TPP | 92024 | |
| Cell culture Flasks | TPP | 90151 | |
| Cell scraper | TPP | 99002 | 24 cm |
| Salmonella entericaserovar Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| BTX ECM630 Electro Cell Manipulator | BTX Harvard Apparatus | ||
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| Ultrasonic liquid processor | Misonix | S-4000 | |
| Cytochalasin-D | Sigma-Aldrich, | C8273 | |
| Formaldehyde | Polysciences | 04018 | |
| Wash buffer | 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS. | ||
| Perm/wash buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Clear-view snap cap microtubes | Sigma | T4816 | |
| Alexa Fluor phalloidin 660 | Invitrogen | A22285 | |
| ImageStreamX | Amnis Corporation | 100200 | Options: 658nm laser, autosampler |
| Sodium azide | Fisher Scientific | S 227I-500 |
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