Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie
Summary
In diesem Artikel beschreiben wir ein Verfahren unter Verwendung von Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie, um die Internalisierung von Polyanhydrid Nanopartikel oder Bakterien durch RAW 264.7-Zellen zu quantifizieren.
Abstract
Nanopartikel-Systemen haben als wertvolle Hilfsmittel zur Verabreichung von Impfstoffen durch ihre Fähigkeit, effizient zu liefern Fracht, einschließlich Proteine entstanden, auf Antigen-präsentierenden Zellen 1-5. Internalisierung von Nanopartikeln (NP) von Antigen-präsentierenden Zellen ist ein kritischer Schritt bei der Erzeugung einer Immunantwort gegen das verkapselte Antigen. Um, wie sich Änderungen in Nanopartikel-Formulierung auswirken Funktion zu bestimmen, haben wir versucht, einen hohen Durchsatz, quantitative experimentelle Protokoll, das kompatibel mit Erkennung internalisierte Nanopartikel sowie Bakterien war zu entwickeln. Bis heute wurden zwei unabhängige Techniken, Mikroskopie und Durchflusszytometrie, waren die Methoden benutzt, um die Phagozytose von Nanopartikeln zu untersuchen. Der hohe Durchsatz Natur der Durchflusszytometrie erzeugt robuste statistische Daten. Jedoch aufgrund der niedrigen Auflösung, schlägt es genau zu quantifizieren verinnerlicht gegenüber Zelle gebundenen Nanopartikeln. Mikroskopie erzeugt Bilder mit hoher räumlicher Auflösung; however, es ist zeitaufwendig und birgt kleinen Stichproben 6-8. Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie (MIFC) ist eine neue Technologie, die sowohl Aspekte der Mikroskopie und Durchflusszytometrie, die Multi-Color-spektralen Fluoreszenz-und Hellfeld-Bildgebung führt gleichzeitig durch eine Laminar-Kern enthält. Dadurch ist eine genaue Analyse des Fluoreszenzsignals Intensitäten und räumlichen Beziehungen zwischen unterschiedlichen Strukturen und zellulären Eigenschaften bei hoher Geschwindigkeit.
Hier beschreiben wir ein Verfahren unter Verwendung MIFC um die Zellpopulationen, die Polyanhydrid Nanopartikel oder Salmonella enterica Serovar Typhimurium verinnerlicht haben zu charakterisieren. Wir beschreiben die Herstellung von Nanopartikel-Suspensionen, Zellmarkierung, Erwerb auf einem ImageStream X-System und die Analyse der Daten mit Hilfe des IDEAS-Anwendung. Darüber hinaus zeigt die Anwendung einer Technik, die verwendet werden, um die Internalisierung p unterschieden werden könnenathways für Nanopartikel und Bakterien mit Cytochalasin-D als ein Inhibitor der Aktin-vermittelte Phagozytose.
Protocol
Discussion
Studien haben gezeigt, dass biologisch abbaubare Nanopartikel auf Basis von Poly (milchsäure-co-Glykolsäure (PLGA) oder Polyanhydriden verwendet werden, um eingeschlossene Antigene oder Medikamente Zielzellen abzugeben. Aufnahme dieser Nanopartikel von phagozytischen Zellen auf ihre Wirksamkeit wichtig, damit quantitative . Analyse der Internalisierung kritisch bei der Entwicklung neuartiger Nanopartikel-Delivery-Systeme Mit dieser Methode können differentielle Aufnahme von Nanopartikeln in verschiedenen Zelltypen mi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die ONR-Muri Award (NN00014-06-1-1176) und das US Army Medical Research und Materiel Command (Grant Numbers W81XWH-09-1 bis 0386 und W81XWH-10-1-0806) für die finanzielle danken zu unterstützen.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| RAW 264.7 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | TIB-71 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S 11150 | Premium Grade |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 24-well plate | TPP | 92024 | |
| Cell culture Flasks | TPP | 90151 | |
| Cell scraper | TPP | 99002 | 24 cm |
| Salmonella entericaserovar Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| BTX ECM630 Electro Cell Manipulator | BTX Harvard Apparatus | ||
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| Ultrasonic liquid processor | Misonix | S-4000 | |
| Cytochalasin-D | Sigma-Aldrich, | C8273 | |
| Formaldehyde | Polysciences | 04018 | |
| Wash buffer | 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS. | ||
| Perm/wash buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Clear-view snap cap microtubes | Sigma | T4816 | |
| Alexa Fluor phalloidin 660 | Invitrogen | A22285 | |
| ImageStreamX | Amnis Corporation | 100200 | Options: 658nm laser, autosampler |
| Sodium azide | Fisher Scientific | S 227I-500 |
References
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