Шаг за шагом метод для разведения Transporter ABC в Nanodisc липидных частиц

Summary

Nanodiscs малых дисковидные частицы, которые включают мембранных белков в небольшой патч фосфолипидного бислоя. Мы предоставляем визуальный протокол, который показывает, шаг за шагом включения MalFGK2 транспортера на диск.

Abstract

Nanodisc является дисковидные частицы (~ 10-12 нм большой), что ловушка мембранных белков в небольшой патч фосфолипидного бислоя. Nanodisc является особенно привлекательным вариантом для исследования мембранных белков, особенно в контексте лиганд-рецепторных взаимодействий. Метод пионером Sligar и коллегами основана на амфипатическими свойства разработаны высоко-спиральной эшафот белок, полученный из аполипопротеина A1. Гидрофобные лица белка эшафот взаимодействовать с ацил боковых цепей липидного бислоя в то время как полярные регионы сталкиваются с водной средой. Анализы мембранных белков в nanodiscs имеют значительные преимущества по сравнению с липосомами, поскольку частицы мелкие, однородные и растворимые в воде. Кроме того, биохимических и биофизических методов обычно зарезервированы для растворимых белков могут быть применены, и по обе стороны от мембраны. В этой визуальной протокол, мы представляем шаг за шагом, восстановление и характеристикиризуется бактериальных транспортеров ABC, мужчины MalFGK ₂ комплекса. Формирование диска процесса самосборки, что зависит от гидрофобных взаимодействий, происходящих в ходе постепенного устранения моющего средства. Мы опишем основные шаги, и мы подчеркиваем важность выбора правильного белок-липидного соотношения для того, чтобы ограничить образование агрегатов и больше полидисперсных липосомы частицы. Простой контроля качества, такие как гель-фильтрации хроматографии, родной гель-электрофореза и спектроскопии динамического рассеяния света убедиться, что диски были должным образом восстановлена.

Protocol

Общий процесс разведения Начнется процесс восстановления путем смешивания мембраны эшафот белка (MSP) с очищенной MalFGK 2 комплекса в присутствии детергента солюбилизированной фосфолипидов. Этот шаг последующим медленным удаления моющего средства по адсорбента м…

Discussion

Мы опишем простую процедуру для разведения мальтоза транспортера в nanodiscs. Транспортер АТФазы активного и взаимодействия с растворимым обязательного партнера-мужчины могут быть воссозданы (рис. 3). Успешное восстановление транспортера в nanodiscs открыть путь для дополнительного …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter	Millipore	UFC805008	Follow manufacturer’s protocol for proper use
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920
E. coli total lipids	Avanti Polar Lipids	100500C	Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent
Ni sepharose HP resin	GE Healthcare	17-5268-01
Phosphorous standard solution	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
			Table I. Specific reagents.
			Name Composition Comments DDM stock 10% w/v DDM Resuspend in milliQ water and store at -20 °C MalFGK2 stock 1-2 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at -70 °C after purification MSP stock 10-15 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles Phospholipid stock 5 nM E. coli total lipids 0.5% w/v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C for 1 week TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at 4 °C TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH8 100 mM NaCl 20% v/v glycerol Store at 4 °C TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at 4 °C and add DDM just before use Table II. Solution recipes.