Un método paso a paso para la reconstitución de un transportador ABC en partículas lipídicas Nanodisc

Summary

Nanodiscos son pequeñas partículas discoidales que incorporan proteínas de membrana en un pequeño parche de doble capa de fosfolípidos. Proporcionamos un protocolo visual que muestra la incorporación paso a paso del transportador de MalFGK2 en un disco.

Abstract

El nanodisc es una partícula discoidal (~ 10-12 nm grande) que las proteínas de membrana trampa en un pequeño parche de doble capa de fosfolípidos. El nanodisc es una opción particularmente atractiva para el estudio de proteínas de membrana, especialmente en el contexto de las interacciones ligando-receptor. El método por primera vez por Sligar y colegas se basa en las propiedades anfipáticas de una ingeniería altamente a-helicoidal andamio de proteínas derivadas de la apolipoproteína A1. Las caras hidrófobas de la proteína andamio interactúan con los de acilo graso cadenas laterales de la bicapa de lípido, mientras que las regiones polares frente al entorno acuoso. Los análisis de proteínas de membrana en nanodiscos tienen ventajas significativas sobre liposoma porque las partículas son pequeñas, homogéneas y solubles en agua. Además, los métodos bioquímicos y biofísicos normalmente reservados para las proteínas solubles se pueden aplicar, y desde ambos lados de la membrana. En este protocolo visual, se presenta una reconstitución paso a paso de un carácter bienracterizado ABC transportador bacteriano, el _macho-2 MalFGK complejo. La formación del disco es un proceso de auto-ensamblaje que depende de las interacciones hidrofóbicas que tienen lugar durante la eliminación progresiva del detergente. Se describen los pasos esenciales y se destaca la importancia de elegir una correcta proteína-lípido con el fin de limitar la formación de agregados y partículas más grandes de liposomas como polidispersos. Calidad simples controles, tal como cromatografía de filtración en gel, electroforesis en gel nativo y la espectroscopia de dispersión de luz dinámica asegurar que los discos han sido correctamente reconstituido.

Protocol

Proceso de reconstitución global El proceso de reconstitución se inicia mediante la mezcla de la proteína de membrana andamio (MSP) con el complejo purificado MalFGK 2 en presencia de solubilizadas en detergente fosfolípidos. El paso es seguido por la eliminación lenta del detergente por un material de poliestireno adsorbente llamado Bio-Beads o Amberlite (Figura 1). El proceso de auto-ensamblaje ocurre muy probablemente debido a las interacciones apolares…

Discussion

Se describe un procedimiento sencillo para la reconstitución del transportador de maltosa en nanodiscos. El transportador es ATPasa activa y la interacción con el macho pareja de unión soluble puede ser recreada (Figura 3). La reconstitución exitosa del transportador en nanodiscos abrir el camino para un análisis adicional biofísica y bioquímica. De particular interés será el análisis sistemático de la ATPasa y la actividad Malk maltosa transporte en el detergente, liposomas y nanodiscos. Tra…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter	Millipore	UFC805008	Follow manufacturer’s protocol for proper use
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920
E. coli total lipids	Avanti Polar Lipids	100500C	Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent
Ni sepharose HP resin	GE Healthcare	17-5268-01
Phosphorous standard solution	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
			Table I. Specific reagents.
			Name Composition Comments DDM stock 10% w/v DDM Resuspend in milliQ water and store at -20 °C MalFGK2 stock 1-2 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at -70 °C after purification MSP stock 10-15 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles Phospholipid stock 5 nM E. coli total lipids 0.5% w/v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C for 1 week TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at 4 °C TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH8 100 mM NaCl 20% v/v glycerol Store at 4 °C TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at 4 °C and add DDM just before use Table II. Solution recipes.