A أسلوب الخطوة بخطوة لإعادة تشكيل ناقلة الى جزيئات الدهون ABC Nanodisc

Summary

Nanodiscs هي جسيمات صغيرة القرصية التي تتضمن البروتينات الغشاء في قطعة صغيرة من طبقة ثنائية فسفوليبيد. نحن نقدم بروتوكول البصرية التي تظهر إدماج خطوة بخطوة من نقل MalFGK2 إلى القرص.

Abstract

وnanodisc هو الجسيمات قريصي (~ 10-12 نانومتر الكبيرة) أن البروتينات الغشاء فخ في قطعة صغيرة من طبقة ثنائية فسفوليبيد. وnanodisc هو خيارا جذابا بشكل خاص لدراسة البروتينات الغشاء، وخاصة في سياق يجند مستقبلات التفاعلات. رائدا في الطريقة التي Sligar ويقوم الزملاء على خصائص متقابلة الزمر من المهندسة عالية A-حلزونية سقالة البروتين المستمد من A1 ئي. وجوه مسعور من البروتين سقالة التفاعل مع سلاسل جانبية أسيل الدهنية من طبقة ثنائية المادة الدهنية في حين أن المناطق القطبية تواجه البيئة المائية. تحليل البروتينات الغشاء في nanodiscs لها مزايا هامة على الحويصلية لأن جزيئات صغيرة، متجانسة وللذوبان في الماء. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق أساليب الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية التي عادة ما تحجز للبروتينات قابلة للذوبان، ومن جانبي الغشاء. في هذا البروتوكول البصرية، فإننا نقدم إعادة خطوة بخطوة من charac جيداterized نقل ABC البكتيرية، والذكور ₂ MalFGK المعقدة. تشكيل القرص هو عملية التجميع الذاتي التي تعتمد على التفاعلات التي تحدث أثناء مسعور في الإزالة التدريجية للمواد التنظيف. نحن وصف الخطوات الأساسية ونسلط الضوء على أهمية اختيار الصحيح البروتين إلى الدهون نسبة للحد تشكيل المجاميع والجسيمات الأكبر حجما polydisperse الحويصلية مثل. نوعية بسيطة مثل اللوني يتحكم الترشيح هلام، هلام الكهربائي الأصلي وديناميكية تشتت الضوء الطيفي ضمان أنه تم تشكيل الأقراص بشكل صحيح.

Protocol

وعموما عملية إعادة إعماره عملية إعادة خلط يبدأ الغشاء سقالة البروتين (MSP) مع مجمع تنقية 2 MalFGK في وجود المنظفات الفوسفاتية-solubilized. ويتبع الخطوة عن طريق إزالة البطيء للالمنظفات من مادة البوليسترين الممتزات دعا بيو الخرز أو Amb…

Discussion

وصفنا إجراء بسيط لإعادة تشكيل المالتوز في نقل nanodiscs. الناقل هو أتباز نشطة ويمكن أن يعاد التفاعل مع شريك ذكر ملزمة للذوبان (الشكل 3). إعادة تشكيل ناجحة للنقل في nanodiscs فتح الطريق لتحليل إضافية البيوفيزيائية والكيميائية الحيوية. سوف تكون ذات أهمية خاصة في التحلي?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter	Millipore	UFC805008	Follow manufacturer’s protocol for proper use
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920
E. coli total lipids	Avanti Polar Lipids	100500C	Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent
Ni sepharose HP resin	GE Healthcare	17-5268-01
Phosphorous standard solution	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
			Table I. Specific reagents.
			Name Composition Comments DDM stock 10% w/v DDM Resuspend in milliQ water and store at -20 °C MalFGK2 stock 1-2 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at -70 °C after purification MSP stock 10-15 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles Phospholipid stock 5 nM E. coli total lipids 0.5% w/v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C for 1 week TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at 4 °C TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH8 100 mM NaCl 20% v/v glycerol Store at 4 °C TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at 4 °C and add DDM just before use Table II. Solution recipes.