Nanodiscs er små skiveformede partikler, der inkorporerer membranproteiner i et lille plaster på phospholipid dobbeltlag. Vi giver en visuel protokol, der viser trin for trin inkorporering af MalFGK2 transportør til en skive.
Det nanodisc er en skiveformede partikel (~ 10-12 nm stor) at fælde membranproteiner i et lille plaster på phospholipid dobbeltlag. The nanodisc er en særlig attraktiv mulighed for at studere membranproteiner, specielt i forbindelse med ligand-receptor-interaktioner. Fremgangsmåden udviklet af Sligar og kolleger er baseret på de amfipatiske egenskaber af et manipuleret højt a-helisk scaffold protein fra apolipoprotein A1. De hydrofobe overflader af stillads-proteinet interagerer med fedtacyl sidekæder af lipiddobbeltlaget henviser polaregnene står det vandige miljø. Analyser af membranproteiner i nanodiscs har betydelige fordele i forhold liposom fordi partiklerne er små, ensartede og vandopløseligt. Endvidere kan biokemiske og biofysiske metoder normalt forbeholdt opløselige proteiner anvendes, og fra begge sider af membranen. I denne visuelle protokol, vi præsenterer en trin-for-trin rekonstituering af et godt kendetegnterized bakteriel ABC transportvirksomheden, mandlige-MalFGK 2-kompleks. Dannelsen af skiven er en selvsamling proces, der afhænger af hydrofobe interaktioner, der finder sted ved den gradvise fjernelse af detergenten. Vi beskriver de væsentlige trin, og vi fremhæver betydningen af at vælge en korrekt protein-til-lipidforhold for at begrænse dannelsen af aggregater og større polydisperse liposom-lignende partikler. Simple kvalitetskontrol, såsom gelfiltreringschromatografi, nativ gelelektroforese og dynamisk lysspredning spektroskopi sikre, at skiverne er blevet korrekt rekonstitueres.
Vi beskriver en enkel procedure til rekonstituering af maltose transportør i nanodiscs. Transportvirksomheden er ATPase aktiv og samspillet med det opløselige bindingspartner MalE kan genskabes (Figur 3). Den vellykkede rekonstituering af transportøren i nanodiscs bane vej for yderligere biofysiske og biokemiske analyser. Af særlig interesse vil være en systematisk analyse af Malk ATPase og maltose transport aktivitet i vaskemiddel, liposom og nanodiscs. ABC-transportører ændrer konformationer un…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af den canadiske Institute of Health Research. CSC blev finansieret af et postdoc-stipendium fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. FD er en Tier II Canada Research Chair.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter | Millipore | UFC805008 | Follow manufacturer’s protocol for proper use | ||||||||||||||||||||||||||||||
Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | |||||||||||||||||||||||||||||||
E. coli total lipids | Avanti Polar Lipids | 100500C | Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent | ||||||||||||||||||||||||||||||
Ni sepharose HP resin | GE Healthcare | 17-5268-01 | |||||||||||||||||||||||||||||||
Phosphorous standard solution | Sigma-Aldrich | P3869 | |||||||||||||||||||||||||||||||
pMSP1D1 | Addgene | 20061 | |||||||||||||||||||||||||||||||
Superdex 200 HR 10/300 | GE Healthcare | 17-5172-01 | |||||||||||||||||||||||||||||||
Table I. Specific reagents. | |||||||||||||||||||||||||||||||||
|