Une méthode étape par étape pour la reconstitution d'un transporteur ABC dans des particules lipidiques Nanodisc

Summary

NANODISQUES sont de petites particules discoïdes qui incorporent des protéines membranaires dans un petit lopin de bicouche phospholipidique. Nous fournir un protocole visuelle montre que l'incorporation étape par étape du transporteur MalFGK2 dans un disque.

Abstract

Le nanodisc est une particule en forme de disque (~ 10-12 nm grande) que les protéines membranaires piège dans une petite parcelle de bicouche phospholipidique. Le nanodisc est une option particulièrement intéressante pour l'étude des protéines membranaires, en particulier dans le contexte de interactions ligand-récepteur. Le procédé mis au point par Sligar et ses collaborateurs est basée sur les propriétés amphipathiques d'une ingénierie très une hélice protéine extraite de l'échafaudage apolipoprotéines A1. Les faces hydrophobes de la protéine d'échafaudage interagir avec les acyles gras des chaînes latérales de la bicouche lipidique, alors que les régions polaires face à l'environnement aqueux. L'analyse des protéines membranaires ont NANODISQUES avantages significatifs par rapport liposome, car les particules sont petites, homogène et soluble dans l'eau. En outre, les méthodes biochimiques et biophysiques normalement réservés à des protéines solubles peuvent être appliqués, et de part et d'autre de la membrane. Dans ce protocole visuelle, nous présentons une reconstitution étape par étape, d'un caractère bientérisée transporteur ABC bactérien, le mâle-MalFGK complexe _2. La formation du disque est un processus d'auto-assemblage qui dépend des interactions hydrophobes qui ont lieu au cours de l'élimination progressive du détergent. Nous décrivons les étapes essentielles et nous soulignons l'importance de choisir un bon protéine-lipide rapport afin de limiter la formation d'agrégats et les grands polydisperses liposomes comme des particules. Contrôle qualité simples telles que la chromatographie de filtration sur gel, l'électrophorèse sur gel natif et dynamique spectroscopie de diffusion de lumière en sorte que les disques ont été correctement reconstitué.

Protocol

Processus de reconstitution globale Le processus de reconstitution commence par mélanger la protéine d'échafaudage membranaire (MSP) avec le complexe purifié MalFGK 2 en présence d'un détergent-solubilisées phospholipides. L'étape est suivie de l'élimination lente de la lessive par un matériau adsorbant en polystyrène appelé Bio-Beads ou Amberlite (figure 1). Le processus d'auto-assemblage se produit probablement en raison des in…

Discussion

Nous décrivons une procédure simple pour la reconstitution du transporteur maltose en NANODISQUES. Le transporteur est ATPase active et l'interaction avec le mâle partenaire de liaison soluble peut être recréé (figure 3). La reconstitution réussie du transporteur en NANODISQUES ouvrir la voie à l'analyse biophysique et biochimique supplémentaire. D'un intérêt particulier sera l'analyse systématique de l'ATPase MalK et de l'activité de transport du maltose dans du dé…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter	Millipore	UFC805008	Follow manufacturer’s protocol for proper use
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920
E. coli total lipids	Avanti Polar Lipids	100500C	Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent
Ni sepharose HP resin	GE Healthcare	17-5268-01
Phosphorous standard solution	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
			Table I. Specific reagents.
			Name Composition Comments DDM stock 10% w/v DDM Resuspend in milliQ water and store at -20 °C MalFGK2 stock 1-2 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at -70 °C after purification MSP stock 10-15 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles Phospholipid stock 5 nM E. coli total lipids 0.5% w/v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C for 1 week TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at 4 °C TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH8 100 mM NaCl 20% v/v glycerol Store at 4 °C TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at 4 °C and add DDM just before use Table II. Solution recipes.