A Step-by-step Metode for Rekonstituering av en ABC Transporter inn Nanodisc lipidpartikler

Summary

Nanodiscs er små discoid partikler som inneholder membran proteiner i en liten oppdatering av fosfolipid bilayer. Vi tilbyr en visuell protokoll som viser trinn-for-trinn innlemmelse av MalFGK2 transporter inn en plate.

Abstract

Den nanodisc er en skiveformede partikkel (~ 10-12 nm store) som felle membran proteiner i en liten oppdatering av fosfolipid bilayer. Den nanodisc er et spesielt attraktivt alternativ for å studere membran proteiner, spesielt i sammenheng av ligand-reseptor interaksjoner. Metoden utviklet av Sligar og kolleger er basert på amfipatiske egenskapene til en konstruert svært en-helical scaffoldprotein avledet fra apolipoprotein A1. De hydrofobe ansikter av scaffoldprotein samhandle med fettsyreasylgrupper side-kjeder av lipid bilayer mens polarområdene ansikt vandige miljø. Analyser av membran proteiner i nanodiscs har betydelige fordeler fremfor liposom fordi partiklene er små, homogen og vannoppløselig. I tillegg kan biokjemiske og biofysiske metoder normalt reservert til løselige proteiner bli brukt, og fra begge sider av membranen. I denne visuelle protokollen, presenterer vi en steg-for-steg omdanning av et godt karakteriserte d bakteriell ABC transportør, den mannlige-MalFGK ₂ kompleks. Dannelsen av platen er en selv-oppsettingen som avhenger hydrofobe interaksjoner finner sted under den progressive fjerning av vaskemiddel. Vi beskriver de grunnleggende trinnene og vi markere betydningen av å velge en riktig protein-til-lipid forholdet for å begrense dannelsen av aggregater og større polydisperse liposom-lignende partikler. Enkelt kvalitetskontroller eksempel gelfiltrering kromatografi, innfødt gelelektroforese og dynamisk lysspredning spektroskopi sikre at platene har blitt riktig rekonstituert.

Protocol

Samlet Rekonstituering Process Tilberedning Prosessen starter ved å blande membranen scaffoldprotein (MSP) med rensede MalFGK 2 kompleks i nærvær av vaskemiddel-solubilisert fosfolipider. Trinnet er etterfulgt av langsom fjerning av vaskemiddel ved en adsorbent polystyren materiale kalt Bio-perler eller Amberlite (figur 1). Den automatiske forsamlingen prosessen skjer mest sannsynlig på grunn av apolare interaksjoner mellom de hydrofobe fosfolipider, den Ma…

Discussion

Vi beskriver en enkel prosedyre for rekonstituering av maltose transporter inn nanodiscs. Transportøren er ATPasen aktiv og samspillet med oppløselig bindingspartner MALE kan gjenskapes (figur 3). Den vellykkede rekonstituering av transportøren i nanodiscs åpne veien for ytterligere biofysiske og biokjemiske analyser. Av særlig interesse vil være systematisk analyse av Malk ATPase og maltose transport aktivitet i vaskemiddel, liposome og nanodiscs. ABC transportører endrer konformasjonen under tr…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter	Millipore	UFC805008	Follow manufacturer’s protocol for proper use
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920
E. coli total lipids	Avanti Polar Lipids	100500C	Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent
Ni sepharose HP resin	GE Healthcare	17-5268-01
Phosphorous standard solution	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
			Table I. Specific reagents.
			Name Composition Comments DDM stock 10% w/v DDM Resuspend in milliQ water and store at -20 °C MalFGK2 stock 1-2 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at -70 °C after purification MSP stock 10-15 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles Phospholipid stock 5 nM E. coli total lipids 0.5% w/v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C for 1 week TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at 4 °C TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH8 100 mM NaCl 20% v/v glycerol Store at 4 °C TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at 4 °C and add DDM just before use Table II. Solution recipes.