Um método passo-a-passo para a reconstituição de um transportador ABC em partículas lipídicas Nanodisc

Summary

Nanodiscs são pequenas partículas discóides que incorporam proteínas de membrana em um pequeno pedaço de bicamada de fosfolipídios. Nós fornecemos um protocolo visual que mostra a incorporação passo-a-passo do transportador MalFGK2 em um disco.

Abstract

O nanodisc é uma partícula discoidal (~ 10-12 nm grande) que as proteínas de membrana armadilha em um pequeno pedaço de bicamada de fosfolipídios. O nanodisc é uma opção particularmente atraente para o estudo de proteínas de membrana, especialmente no contexto de interacção ligando-receptor. O método pioneiro Sligar e colegas baseia-se nas propriedades anfipáticas de uma engenharia altamente helicoidal uma proteína derivada do andaime apolipoproteína A1. As faces hidrofóbicas da proteína andaime interagir com os acilo gordos de cadeias laterais na bicamada lipídica que as regiões polares enfrentam o meio ambiente aquoso. As análises de proteínas de membrana em nanodiscs têm vantagens significativas sobre os lipossomas porque as partículas são pequenas, homogénea e solúvel em água. Além disso, os métodos bioquímicos e biofísicos normalmente reservadas para proteínas solúveis pode ser aplicada, e a partir de ambos os lados da membrana. Neste protocolo visual, apresenta-se uma reconstituição passo-a-passo de uma caracte bemterizada transportador ABC bacteriana, o macho-MalFGK complexo _2. A formação do disco é um processo de auto-montagem, que depende de interacções hidrofóbicas que têm lugar durante a remoção progressiva do detergente. Descrevem-se os passos essenciais e destaca-se a importância de escolher a proporção entre proteína e lípido-correcta, a fim de limitar a formação de agregados maiores e polidispersos lipossoma partículas semelhantes. Qualidade simples controles, tais como cromatografia de filtração em gel, electroforese em gel nativa e espectroscopia de dispersão de luz dinâmica garantir que os discos foram correctamente reconstituído.

Protocol

Processo geral de reconstituição O processo de reconstituição é iniciado por mistura da proteína de membrana de andaime (MSP) purificado com o MalFGK complexo 2, na presença de detergente solubilizados fosfolípidos. O passo é seguido pela remoção lenta do detergente por um material adsorvente chamado poliestireno Bio-Beads ou Amberlite (Figura 1). O processo de auto-montagem ocorre provavelmente devido às interacções entre os fosfolípidos apolare…

Discussion

Descreve-se um procedimento simples para a reconstituição do transportador de maltose em nanodiscs. O transportador é ATPase ativa e da interação com o macho parceiro solúvel ligação pode ser recriado (Figura 3). A reconstituição bem sucedida do transportador em nanodiscs abrir o caminho para análise biofísica e bioquímica suplementar. De interesse particular será a análise sistemática da ATPase Malk e maltose a actividade de transporte de detergente, lipossomas e nanodiscs. Transportado…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter	Millipore	UFC805008	Follow manufacturer’s protocol for proper use
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920
E. coli total lipids	Avanti Polar Lipids	100500C	Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent
Ni sepharose HP resin	GE Healthcare	17-5268-01
Phosphorous standard solution	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
			Table I. Specific reagents.
			Name Composition Comments DDM stock 10% w/v DDM Resuspend in milliQ water and store at -20 °C MalFGK2 stock 1-2 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at -70 °C after purification MSP stock 10-15 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles Phospholipid stock 5 nM E. coli total lipids 0.5% w/v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C for 1 week TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at 4 °C TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH8 100 mM NaCl 20% v/v glycerol Store at 4 °C TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at 4 °C and add DDM just before use Table II. Solution recipes.