En steg-för-steg metod för beredning av en ABC Transporter i Nanodisc lipidpartiklar

Summary

Nanodiscs är små skivformiga partiklar som innehåller membranproteiner i en liten lapp av fosfolipid tvåskiktsmembran. Vi tillhandahåller en visuell protokoll som visar steg-för-steg inkorporering av MalFGK2 transportören till en skiva.

Abstract

Det nanodisc är en skivformig partikel (~ 10-12 nm stor) den fällan membranproteiner i en liten bit fosfolipid tvåskiktsmembran. Den nanodisc är ett särskilt attraktivt alternativ för att studera membranproteiner, i synnerhet inom ramen av ligand-receptor-interaktioner. Metoden uppfunnen av Sligar och kollegor bygger på amfipatiska egenskaperna hos en konstruerad mycket en-spiralformad byggnadsställning protein från apolipoprotein A1. De hydrofoba ytor schavotten proteinet interagera med fettacyl sidokedjor av lipiddubbelskiktet medan polarområdena inför den vattenhaltiga omgivningen. Analyser av membranproteiner i nanodiscs har betydande fördelar jämfört med liposom eftersom partiklarna är små, homogena och vatten-lösliga. Dessutom, kan biokemiska och biofysiska metoder som normalt reserveras för lösliga proteiner appliceras, och från vardera sidan av membranet. I denna visuella protokoll, presenterar vi ett steg-för-steg rekonstitution av en väl teckenterized bakteriellt ABC-transportprotein, de manliga-MalFGK ₂ komplex. Bildandet av skivan är en självorganiserande processen som beror på hydrofoba interaktioner som äger rum under det gradvisa avlägsnandet av tvättmedlet. Vi beskriver de viktigaste stegen och vi betona vikten av att välja rätt protein-till-lipid för att begränsa bildandet av aggregat och större polydispersa liposom-liknande partiklar. Enkel kvalitetskontroller såsom gelfiltreringskromatografi, nativ gelelektrofores och dynamisk ljusspridning spektroskopi säkerställa att skivorna har blivit riktigt rekonstituerats.

Protocol

Övergripande Beredning Process Den beredning startar genom att blanda membranet ställningen proteinet (MSP) med den renade MalFGK 2 komplexet i närvaro av detergent-solubiliserade fosfolipider. Det steget följs av långsamma avlägsnande av detergenten genom ett adsorberande polystyrenmaterialet kallas Bio-Beads eller Amberlite (figur 1). Den automatiska monteringen sker troligen på grund av de opolära växelverkan mellan de hydrofoba fosfolipider, den Ma…

Discussion

Vi beskriver ett enkelt förfarande för beredning av maltos transportören till nanodiscs. Transportören är ATPas aktiv och samspelet med den lösliga bindningspartnern MalE kan återskapas (Figur 3). Den framgångsrika rekonstituering av transportören till nanodiscs bana väg för ytterligare biofysiska och biokemiska analyser. Av särskilt intresse är den systematiska analysen Malk ATPas och maltos transportverksamhet i tvättmedel, liposom och nanodiscs. ABC transportörer byter konformationer u…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter	Millipore	UFC805008	Follow manufacturer’s protocol for proper use
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920
E. coli total lipids	Avanti Polar Lipids	100500C	Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent
Ni sepharose HP resin	GE Healthcare	17-5268-01
Phosphorous standard solution	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
			Table I. Specific reagents.
			Name Composition Comments DDM stock 10% w/v DDM Resuspend in milliQ water and store at -20 °C MalFGK2 stock 1-2 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at -70 °C after purification MSP stock 10-15 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles Phospholipid stock 5 nM E. coli total lipids 0.5% w/v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C for 1 week TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at 4 °C TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH8 100 mM NaCl 20% v/v glycerol Store at 4 °C TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at 4 °C and add DDM just before use Table II. Solution recipes.