Nanodisc लिपिड कणों में एक एबीसी ट्रांसपोर्टर के पुनर्गठन के लिए एक विधि कदम दर कदम
Summary
Nanodiscs छोटे चक्रिकाभ कणों कि फॉस्फोलिपिड bilayer के एक छोटे पैच में झिल्ली प्रोटीन को शामिल कर रहे हैं. हम एक दृश्य प्रोटोकॉल है कि एक डिस्क में MalFGK2 ट्रांसपोर्टर के समावेश कदम दर कदम से पता चलता है प्रदान करते हैं.
Abstract
nanodisc एक चक्रिकाभ (बड़े ~ 10-12 एनएम) कण कि फॉस्फोलिपिड bilayer के एक छोटे पैच में जाल झिल्ली प्रोटीन. nanodisc झिल्ली प्रोटीन ligand-रिसेप्टर बातचीत के संदर्भ में विशेष रूप से, के अध्ययन के लिए एक विशेष रूप से आकर्षक विकल्प है. विधि Sligar ने बीड़ा उठाया है और उनके सहयोगियों ने एक इंजीनियर अत्यधिक एक पेचदार पाड़ अपोलीपोप्रोटीन A1 से व्युत्पन्न प्रोटीन के amphipathic गुणों पर आधारित है. पाड़ प्रोटीन की hydrophobic चेहरे फैटी लिपिड bilayer के एसाइल पक्ष श्रृंखला के साथ बातचीत जबकि ध्रुवीय क्षेत्रों जलीय वातावरण का सामना करना पड़ता है. Nanodiscs में झिल्ली प्रोटीन का विश्लेषण liposome अधिक महत्वपूर्ण लाभ है, क्योंकि छोटे कणों, सजातीय और पानी में घुलनशील हैं. इसके अलावा, जैव रासायनिक और biophysical घुलनशील प्रोटीन के लिए सामान्य रूप से सुरक्षित तरीके लागू किया जा सकता है और झिल्ली के दोनों ओर से. इस दृश्य प्रोटोकॉल में, हम एक अच्छी तरह से चरित्र की एक पुनर्गठन कदम दर कदम उपस्थितterized बैक्टीरियल एबीसी ट्रांसपोर्टर, पुरुष MalFGK 2 जटिल. डिस्क के गठन प्रक्रिया विधानसभा स्वयं कि hydrophobic डिटर्जेंट के प्रगतिशील हटाने के दौरान जगह लेने के बातचीत पर निर्भर करता है. हम आवश्यक कदम का वर्णन है और हम एक सही अनुपात प्रोटीन लिपिड चुनने के क्रम में करने के लिए समुच्चय और बड़े polydisperse liposome कणों की तरह के निर्माण को सीमा के महत्व पर प्रकाश डाला. सरल जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी, देशी जेल वैद्युतकणसंचलन और गतिशील प्रकाश बिखरने स्पेक्ट्रोस्कोपी के रूप में यह सुनिश्चित करें कि डिस्क ठीक से पुनर्गठन किया गया है गुणवत्ता को नियंत्रित करता है.
Protocol
Discussion
हम nanodiscs में maltose ट्रांसपोर्टर के पुनर्गठन के लिए एक सरल प्रक्रिया का वर्णन करता है. ट्रांसपोर्टर ATPase सक्रिय है और घुलनशील बाध्यकारी साथी पुरुष के साथ बातचीत (3 चित्रा) निर्मित किया जा सकता है. nanodiscs में …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम की कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान द्वारा समर्थित किया गया. सीएससी प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल से एक postdoctoral फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया था. एफडी एक द्वितीय श्रेणी कनाडा अनुसंधान चेयर है.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||
| Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter | Millipore | UFC805008 | Follow manufacturer’s protocol for proper use | ||||||||||||||||||||||||||||||
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | |||||||||||||||||||||||||||||||
| E. coli total lipids | Avanti Polar Lipids | 100500C | Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent | ||||||||||||||||||||||||||||||
| Ni sepharose HP resin | GE Healthcare | 17-5268-01 | |||||||||||||||||||||||||||||||
| Phosphorous standard solution | Sigma-Aldrich | P3869 | |||||||||||||||||||||||||||||||
| pMSP1D1 | Addgene | 20061 | |||||||||||||||||||||||||||||||
| Superdex 200 HR 10/300 | GE Healthcare | 17-5172-01 | |||||||||||||||||||||||||||||||
| Table I. Specific reagents. | |||||||||||||||||||||||||||||||||
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References
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