CHIRP é uma técnica recente e rápida de mapa genômico sítios de ligação de RNAs não-codificantes longos (lncRNAs). O método tira partido da especificidade dos oligonucleótidos anti-sentido ladrilhos para permitir que a enumeração de sítios lncRNA-bound genómicos.
RNAs não-codificantes longos são os reguladores de cromatina principais estados para processos biológicos importantes, como a compensação de dosagem, imprinting e expressão de genes de desenvolvimento 1,2,3,4,5,6,7. A recente descoberta de milhares de lncRNAs em associação com os complexos de cromatina específicos de modificação, tal como o complexo Repressiva Polycomb 2 (PRC2) que medeia a histona H3 lisina 27 trimethylation (H3K27me3), sugere as funções gerais para lncRNAs numerosos estados na gestão de cromatina em um gene específico moda 8,9. Enquanto alguns lncRNAs são pensados para trabalhar em cis em genes vizinhos, lncRNAs outros trabalhar em trans para regular genes localizados distantes. Por exemplo, Drosophila lncRNAs roX1 e roX2 regiões ligam numerosos no cromossomo X de células masculinas, e são críticas para a compensação de dosagem 10,11. No entanto, as localizações exatas dos seus locais de ligação não são conhecidos em alta resolução. Da mesma forma, humana lncRNA hotair pode afectar PRC2 ocupação em hundreds de genes do genoma 3,12,13, mas como especificidade o objectivo é claro. LncRNAs também pode servir como suportes modulares para recrutar o conjunto de complexos de proteínas múltiplas. O clássico trans-acting RNA andaime é o RNA TERC que serve como o modelo e andaime para a telomerase complexo 14; hotair também pode servir como um andaime para PRC2 e um desmetilase H3K4 complexo 13.
Estudos anteriores de mapeamento de ocupação de RNA em cromatina revelaram percepções substanciais 15,16, mas apenas com um único locus do gene de cada vez. Os locais de ocupação da maioria dos lncRNAs não são conhecidos, e os papéis de lncRNAs na regulação da cromatina foram principalmente inferida a partir dos efeitos indiretos da perturbação lncRNA. Assim como imunoprecipitação de cromatina seguido por microarray ou seqüenciamento profunda (CHIP CHIP ou CHIP-seq, respectivamente) tem melhorado muito a nossa compreensão de interações DNA-proteína em escala genômica, aqui nós ilustrar um Recenqüentemente publicado estratégia para mapear ocupação RNA longo de todo o genoma em alta resolução 17. Este método de isolamento, cromatina pela RNA Purificação (CHIRP) (Figura 1), baseia-se na captura de afinidade de alvo lncRNA: Complexo de cromatina por ladrilhos anti-sentido-oligos, que gera então um mapa de sítios de ligação genómicos com uma resolução de várias centenas de bases com sensibilidade elevada e baixa do fundo. CHIRP é aplicável a muitos lncRNAs porque o desenho de afinidade sondas é simples, dada a sequência de RNA e não requer conhecimento da estrutura do RNA ou domínios funcionais.
Aqui descrevemos CHIRP-seq, um método de mapeamento em sites in vivo lncRNA ligação do genoma. Os principais parâmetros para o sucesso são as piscinas de divisão de azulejos sondas de oligonucleotídeos e reticulação glutaraldeído. A concepção de sondas de afinidade é simples, dada a sequência de RNA e não requer conhecimento prévio da estrutura do RNA ou domínios funcionais. O nosso sucesso com roX2, TERC, e hotair – três RNAs bastante diferentes em duas espécies – sugere que CHIRP-seq provavelmente generalizáveis para lncRNAs muitos. Tal como com todas as experiências, os controlos de cuidados e adequada são necessários para interpretar os resultados. LncRNA diferente pode exigir titulação de condições, ea mudança criteriosa de condições, tais como seleção de sondas diferentes de afinidade ou reticuladores, pode realçar diferentes aspectos da RNA-cromatina interações. Como ChIP seguintes, nem todos os eventos de ligação são, necessariamente, funcional, e estudos adicionais são necessários para verificar as conseqüências biológicas da RNA occupancy em cromatina. No entanto, prevemos muitas aplicações interessantes desta tecnologia para os pesquisadores de outros cromatina associados lncRNAs, cujo número agora na casa dos milhares 8,9. Assim como ChIP-seq abriu a porta para a exploração do genoma de interações DNA-proteína, CHIRP-seq estudos do "RNA interactoma" pode revelar muitos novos caminhos da biologia.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos T. Hung, MC. Tsai, O. Manor, E. Segal, M. Kuroda, T. Swigut, e I. Shestopalov para as discussões. Apoiado pela Agência de Ciência, Tecnologia e Pesquisa de Cingapura (CC), NIH-R01 e R01 CA118750-HG004361 (HYC), e do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (HYC). HYC é um cientista de carreira precoce do Howard Hughes Medical Institute.
Buffer List:
Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20°C.
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer (for DNA)
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4°C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use
Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use
DNA elution Buffer
50 mM NaHCO3
1% SDS
Table of specific reagents and equipment:
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma Aldrich | G5882-10x10ml |
Motorized pellet mixer | VWR | V8185-904 |
Protease inhibitor | Roche | 11873580001 |
PMSF | Sigma Aldrich | 78830 |
Superase-in | Ambion | AM2696 |
Bioruptor | Diagenode | UCD-200 |
Falcon tubes (for sonication) | Corning | 430790 |
Proteinase K | Ambion | AM2546 |
PCR purification kit | Qiagen | 28106 |
C-1 magnetic beads | Invitrogen | 65002 |
PMSF | Sigma Aldrich | P7626-25G |
DynaMag-15 magnet | Invitrogen | 123-01D |
DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
MIRNeasy mini kit | Qiagen | 217004 |
Rnase H | Epicentre | R0601K |
Rnase A | Sigma Aldrich | R4875-100MG |
Phase Lock Gel Heavy | 5 PRIME | 2302810 |
Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
Phenol:chloroform:Isoamyl | Invitrogen | 15593-031 |
Chloroform | Ricca | RSOC0020-1C |
GlycoBlue | Ambion | AM9515 |
Glycine | J.T. Baker | 4057-06 |
PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 10010-049 |
Elution Buffer (EB) | Qiagen | 19086 |
20x SSC | Invitrogen | 15557-036 |
10% SDS | Invitrogen | 15553-027 |
DNA-free | Ambion | AM1906 |
Buffer kit | Ambion | AM9010 |
Formamide | Invitrogen | 15515-026 |