Reinigung und Visualisierung von Lipopolysaccharid aus Gram-negativen Bakterien durch heiße wäßrige-Phenol-Extraktion
Summary
Wir beschreiben ein modifiziertes heißen wässrigen-Phenolextraktion Verfahren zum Reinigen von Lipopolysaccharid (LPS) von Gram-negativen Bakterien. Sobald extrahiert wurden, kann die LPS anschließend durch SDS-PAGE analysiert und visualisiert werden durch direkte Färbung oder Western-Immunoblot-.
Abstract
Lipopolysaccharid (LPS) ist ein wichtiger Bestandteil von Gram-negativen bakteriellen äußeren Membranen. Es ist eine dreigliedrige Molekül, das aus Lipid A, das in der äußeren Membran eingebettet ist, ein Kern-Oligosaccharid und Wiederholen der O-Antigen-Einheiten, die nach außen erstrecken sich von der Oberfläche der Zelle 1, 2. LPS ist ein Molekül, das immundominante wichtig für die Virulenz und Pathogenese vieler Bakterienarten, darunter Pseudomonas aeruginosa, Salmonella-Arten, und Escherichia coli 3-5, und Unterschiede in der LPS O-Antigen-Zusammensetzung bilden die Grundlage für die Serotypisierung der Stämme. LPS wird in Anlage beteiligten Zellen zu Beginn der Infektion Host und bietet Schutz vor Komplement-vermittelte Tötung; Stämme, die LPS fehlt, gedämpft werden kann für die Virulenz 6-8. Aus diesen Gründen ist es wichtig, LPS visualisieren, insbesondere aus klinischen Isolaten. Visualisierung von LPS Bandenmuster und Erkennung durch spezifische einntibodies können nützliche Werkzeuge sein, um Stamm-Linien zu identifizieren und verschiedenen Mutanten zu charakterisieren.
In diesem Bericht beschreiben wir eine heiße wässrige Phenol-Verfahren zur Isolierung und Reinigung von LPS aus Gram-negativen bakteriellen Zellen. Dieses Protokoll ermöglicht die Extraktion von LPS von Nukleinsäuren und Proteinen, die mit Visualisierung von LPS, die mit kürzeren, weniger intensiv Extraktionsverfahren 9 erfolgt stören können. LPS diese Weise hergestellten durch Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und gefärbt direkt unter Verwendung von Kohlenhydrat / Glykoprotein Flecken oder Standard-Silberfärbung Verfahren getrennt werden können. Viele Anti-Seren gegen LPS Antikörper enthalten, dass mit der äußeren Membran-Proteine oder andere antigene Ziele, kann ein Hindernis für kreuzreagieren Reaktivität nach Western-Immunoblot-SDS-PAGE getrennt Zelllysat beobachtet. Protease-Behandlung von Zelllysat allein ist nicht immer ein wirksames Mittel zur Beseitigung dieserHintergrund der Nutzung dieser oder andere Visualisierungs-Methoden. Ferner kann umfangreiche Proteasebehandlung in einem Versuch, dieses Objekt zu entfernen, schlechter Qualität LPS, die nicht gut von einem der vorgenannten Verfahren gelöst führen. Aus diesen Gründen glauben wir, dass das folgende Protokoll, aus Westpahl Jann und 10 angepasst, ideal für die LPS-Extraktion ist.
Protocol
Discussion
Wir haben ein Verfahren zur Reinigung von LPS von anderen zellulären Komponenten, einschließlich Nukleinsäuren und Proteinen beschrieben. Diese Methode bietet eine hohe Qualität LPS, die in einer Reihe von verschiedenen Visualisierungsmethoden, einschließlich des Kohlenhydrat-Färbung der SDS-PAGE-Gelen, wie in 1 gezeigt ist, verwendet werden kann. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um LPS aus einer Vielzahl von Stämmen Serotyp, unter Verwendung spezifischer Antiseren, oder um eine Verwandtschaft zwischen den…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Mittel der National Institutes of Health und der Mukoviszidose-Stiftung unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 04716728001 |
| RNase A | Roche | 10109169001 |
| Proteinase K | Fisher | BP1700 |
| Tris-Saturated Phenol | Fisher | BP1750-100 |
| Diethyl Ether | Thomas Scientific | C313K31 |
| Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Molecular Probes | P20495 |
References
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