Qui, dettaglio una metodologia per l'isolamento rapido delle cellule dendritiche di topo intestinali (DCS) e macrofagi. Caratterizzazione fenotipica di DC intestinali e macrofagi viene eseguita utilizzando multi-color analisi citometrica mentre magnetica arricchimento tallone seguita dalla selezione cellulare viene utilizzato per produrre le popolazioni di elevata purezza per gli studi funzionali.
All'interno l'intestino risiedono popolazioni uniche di cellule immunitarie innate e adattiva che sono coinvolti nella promozione della tolleranza verso la flora commensale e gli antigeni alimentari, mentre in concomitanza rimanendo in bilico per montare le risposte infiammatorie verso invasive 1,2 patogeni. Cellule presentanti l'antigene, in particolare DCS e macrofagi, giocano un ruolo critico nel mantenimento della omeostasi immunitaria intestinale attraverso la loro capacità di percepire e rispondere adeguatamente al microbiota 3-14. Isolamento efficiente di DC intestinali e macrofagi è un passo fondamentale nel caratterizzare il fenotipo e la funzione di queste cellule. Mentre molti metodi efficaci per isolare cellule immunitarie intestinali, compresi DC e macrofagi, sono stati descritti 6,10,15-24, contare su lunghe molte volte digestioni che possono influenzare negativamente l'espressione sulla superficie cellulare antigene, la vitalità cellulare, e / o quantità di cellule. Qui, si dettaglio una metodologia per l'isolamento rapido di un gran numero di viablelettronici, DCS intestinali e macrofagi. Caratterizzazione fenotipica delle DC intestinali e macrofagi viene effettuata direttamente colorazione cellule intestinali isolate con specifici anticorpi monoclonali marcati a fluorescenza per multi-colore analisi citofluorimetrica. Inoltre, DC altamente puro e popolazioni macrofagi sono isolati per studi funzionali utilizzano CD11c e CD11b magnetico attivati perline di separazione delle cellule seguite da selezione cellulare.
Figura 3. Fattori importanti per l'ottimizzazione della resa delle cellule e l'espressione dell'antigene di superficie. Resa cellulare e l'espressione dell'antigene di superficie sono direttamente interessati dalla durata della digestione dei tessuti, le caratteristiche specifiche del collagenasi, il grado di macinazione dei tessuti e la presenza o l'assenza di infiammazione, che possano pregiudicare l'integ…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Aaron Rae (Emory University Dipartimento di Pediatria e Healthcare bambini di Core flusso Atlanta) per l'ordinamento delle cellule. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH AA01787001, un Career Development Award dal morbo di Crohn e Colite Foundation of America, e della ricerca uno Emory-Egleston Children Center di sementi sovvenzione TLD
Name of the Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
1X PBS, Ca2+– and Mg2+-free | |||
Hank’s balanced salt solution (HBSS) with phenol red | Fisher Scientific | SH3001603 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11150H | Heat-inactivated |
0.5M EDTA (pH 8.0) | Cellgro | 46-034-CI | |
Collagenase type VIII | Sigma | C2139 | |
DNase I | Roche | 14785000 | Stock solution: 100mg/ml |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit for 405 nm excitation | Invitrogen | L34957 | Use at 1:1000 |
CD45-PerCP mAb (30F11) | BD | 557235 | Use at 1:100 |
CD103-PE mAb (M290) | BD | 557495 | Use at 1:100 |
FcγRIII/II mAb (2.4G2) | BD | 553141 | Use at 1:200 |
CD11c-APC mAb (N418) | eBioscience | 17-0114-82 | Use at 1:100 |
MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb | eBioscience | 56-5321-82 | Use at 1:100 |
CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70) | eBioscience | 48-0112-82 | Use at 1:200 |
F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) | eBioscience | 25-4801-82 | |
CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
CD11c microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
Single mesh wire strainer | Chefmate | ||
Small weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-116 | |
100 μm cell strainer | BD Falcon | 352360 | |
40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
5 mL polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352235 | Use at 1:100 |
MaxQ 4450 benchtop orbital shaker | Thermo Scientific | ||
LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
LSR II | BD | ||
FACSAria II | BD |