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Immunology and Infection

ゼブラフィッシュ幼生における播種性カンジダ症の非侵襲的イメージング

Published: July 30, 2012
doi:
10.3791/4051
,
1Department of Molecular and Biomedical Sciences,University of Maine

Summary

ゼブラフィッシュの急速な発展、小型サイズと透明性感染症の自然免疫制御の研究のための途方もない利点があります<sup> 1月4日</sup>。ここでは、真菌性病原体を用いたゼブラフィッシュの幼虫を感染させるためのテクニックを実証する<em>カンジダ·アルビカンス</em>マイクロインジェクションすることによって、方法論は、最近、真菌の二形の制御に食細胞NADPHオキシダーゼ活性を巻き込むために使用さ<sup> 5</sup>。

Abstract

病原体カンジダ·アルビカンスに起因する播種性カンジダ症は、入院して個人の臨床的に重要な問題であり、30から40パーセント起因する死亡率は6に関連付けられています。全身性カンジダ症は、通常、先天性免疫によって制御され、食細胞NADPHオキシダーゼなどの自然免疫細胞成分の遺伝的欠陥を持つ個人は、カンジダ7月9日に影響を受けやすくなります。非常に小さなCのダイナミクスについてはほとんど知られていないin vivoでの自然免疫細胞とカンジダの相互作用。in vitro試験で広範には、ホストCの外側にあること確立していますカンジダは、マクロファージの内部で発芽し、かつ迅速に好中球10月14日によって破壊されています。in vitro試験において 、有用なものの、サイトカイン、細胞外マトリックスの添付ファイル、および細胞間の接点10の時間依存ダイナミクスを含む生体内環境で複雑 ​​なを再現することはできません15から18 </sup>。宿主 – 病原体相互作用におけるこれらの要因の寄与を調べるためには、ライブをそのままホストに非侵襲的に感染のこれらの側面を視覚化するためのモデル生物を見つけることが重要です。

ゼブラフィッシュの幼虫は、感染症の研究のためのユニークで多彩な脊椎動物宿主を提供しています。開発ゼブラフィッシュ幼生の最初の30日間だけ先天性免疫防御2、19-21のような先天性免疫に大きく依存している播種性カンジダ症などの疾患の研究を簡素化しています。ゼブラフィッシュ幼生の小型化と透明性の両方の宿主と病原体の細胞レベルでの感染動態のイメージングを可能にします。生得的な免疫細胞を蛍光トランスジェニック幼虫は感染22から24に関与する特定の細胞型を識別するために使用することができます。変更されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（Morpholinos）は、そのような食細胞NADPHオキシダーゼなどの様々な免疫成分をノックダウンするとfungaへの応答の変化を勉強するために使用することができますlの感染5。小さな下の脊椎動物を使用しての倫理的、実用的な利点に加えて、ゼブラフィッシュの幼虫は、イメージの両方intravitallyと色の病原体とホストの間で激戦を特有の可能性を提供しています。

ゼブラフィッシュは、ヒトの病原性細菌の数のモデル感染症に使用されており、マイコバクテリア感染3、25の私たちの理解に大きな進歩に尽力してきました。しかし、ごく最近そのような幼虫5に感染するために使用されて菌類、23、26とはるかに大きいの病原体を持っており、感染の方法論の詳細な視覚的な説明がされていない最新の状態に。ここでは、以前のプロトコルへの私たちの修正を含むプリム25ゼブラフィッシュ後脳の脳室のマイクロインジェクションは、当社の技術を紹介します。真菌感染症のために幼虫のゼブラフィッシュモデルを使用して、我々の所見は、in vitro試験から分岐し、宿主-病原体interaを検討する必要性を強化ホストではなく、ペトリ皿5の簡素化、システムの複雑な環境でction。

Protocol

すべてのゼブラフィッシュのケアのプロトコルや実験は動物実験及び利用委員会（IACUC）プロトコルA2009-11-01の下に行われた。 1。モルホリノおよび幼虫インジェクション料理 実験期間：*（10-15分） 難易度：* 卵の注射用滅菌水と電子レンジで2％アガロース溶液を調製。解決策は、それが半分に?…

Discussion

ここで紹介するゼブラフィッシュマイクロインジェクション法は、Gutzman らとは異なります。ここではその34我々は36から48 HPF幼虫の後脳室に耳胞を介して注入を示しています。我々は記述方法が減少し組織の損傷と後脳の脳室に10月15日酵母の一貫性の注入を可能にします。このプロトコルは、24 HPI（ 図1）と有意な死亡率/罹病率5の結果から、体全?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、機器の胚の開発と利用をスピードアップについてのアドバイスのためにマイクロインジェクショントレーニング、クラリッサ·ヘンリー博士のキャロル·キムの研究室に感謝したい、とFLI1貢献するためのネイサンローソンう：EGFP魚。私たちは、原稿の重要な読書のためにウィーラーラボとショーン壁のメンバーに感謝します。また、このプロジェクトの技術的助言のために魚のケアとアドバイスをマークNilan、とライアンPhennicieとクリスティンガボールに感謝します。この作品は、K.ブラザーズ、MAFESハッチ助成E08913-08、およびR.ウィーラーにNIH NCRR賞P20RR016463にMAFES研究アシスタントシップによって資金を供給された。

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments (optional)
Spawning tanks Aquatic habitats  2L  
1.7 mL tubes Axygen MCT-175-C
Instant Ocean Fisher Scientific S17957C  
Extra deep Petri dishes Fisher Scientific 08-757-11Z  
Standard Petri dishes VWR Scientific 25384-302
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M  
Yeast Extract VWR Scientific 90000-726  
Peptone VWR Scientific 90000-264  
Dextrose Fisher Scientific D16-1  
Agar VWR Scientific 90000-760  
Disposable Hemocytometer VWR Scientific 82030-468  
Phosphate Buffered Saline VWR Scientific 12001-986  
Dumont Dumoxel Tweezers VWR Scientific 100501-806  
Wooden Dowels VWR Scientific 10805-018
KimWipes VWR Scientific 300053-964
Low Melt Agarose VWR Scientific 12001-722  
Agarose for injection dishes VWR Scientific 12002-102
Flaming Brown Micropipette Puller Sutter Instruments P-97
Hollow glass rods Sutter Instruments BF120-69-10 For glass rods smooth glass by heating over bunsen burner 
Pipette Storage Box Sutter Instruments BX10
MPPI-3 Injection system Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
Back Pressure Unit Applied Scientific Instrumentation BPU  
Micropipette Holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP  
Foot Switch Applied Scientific Instrumentation FSW  
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33  
Magnetic Base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base  
Tricaine methane sulfonate Western Chemical Inc. MS-222  
Dissecting Scope Olympus SZ61 top SZX-ILLB2-100 base  
Confocal Microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system  
TC-7 Tissue Culture Roller drum with 14 inch test tube wheel New Brunswick Scientific  TC-7  
Imaging Dishes MatTek Corporation P24G-1.0-10-F  
Pipette tips for loading needles Eppendorf 930001007  
Plate pouring grids Adaptive Science Tools TU-1
Heated Stage Bioptechs Inc. Delta T-5
Flat Spatula VWR Scientific 82027-486
Plastic Sieves Wares of Knutsford Online 12 cm
Parafilm VWR Scientific 52858-000
Vortex Genie VWR Scientific 14216-184
16 x 150 mm Culture tubes VWR Scientific 60825-435
Nanodrop Thermo Scientific ND 2000
Phenol Red VWR Scientific 97062-478
HCl VWR Scientific 87003-216
NaCl VWR Scientific BDH4534-500GP
KCl VWR Scientific BDH4532-500GP
MgSO4 VWR Scientific BDH0246-500GP
Ca(NO3)2 VWR Scientific BDH0226-500GP
HEPES VWR Scientific BDH4520-500GP
Morpholinos GeneTools, LLC
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References

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