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Immunology and Infection

Zebrafish 애벌레의 분해해 칸디다 증의 비침습 이미징

Published: July 30, 2012
doi:
10.3791/4051
,
1Department of Molecular and Biomedical Sciences,University of Maine

Summary

zebrafish의 급속한 발전, 소형 크기 및 투명성은 감염의 타고난 면역 제어 연구를위한 엄청난 장점입니다<sup> 1-4</sup>. 여기 곰팡이 병원균을 사용 zebrafish 애벌레를 감염시키는 기술을 입증<em> 칸디다 albicans</em> microinjection하여 방법론는 최근 곰팡이 동종 이형 통제하에 식세포 NADPH 산화 효소 활동을 연루하는 데 사용<sup> 5</sup>.

Abstract

병원균 칸디다 albicans에 의한 전파 칸디다 증은 입원 개인에서 임상적으로 중요한 문제이며 30~40% 기인 사망률 6 연결되어 있습니다. 침투성 칸디다 증은 보통 타고난 면역에 의해 제어와 같은 식세포 NADPH 산화 효소로서 타고난 면역 세포 구성 요소의 유전적 결함을 가진 개인은 candidemia 7-9에 더 감염될 수 있습니다된다. 아주 조금은 C.의 역학에 대한 알려져있다 생체내의 타고난 면역 세포와 albicans 상호 작용. 체외 연구에서 광범위한 설립 있지 않은 호스트 C의 외부 albicans은 macrophages 안에서 germinates, 빠르게 neutrophils 10-14 의해 파괴된다. 체외 연구에서 유용하지만, 시토킨 레벨, 세포외 기질 첨부 파일 및 세포 연락처 10 시간 종속적인 역학을 포함 생체내 환경에서 복잡한 요점을 되풀이 수 없습니다 15-18 </sup>. 호스트 병원체 상호 작용에서 이러한 요인 공헌을 알아내기 위해서는 살아있는 그대로 호스트에 비 invasively 감염의 이러한 측면을 시각화하는 모델 생물을 찾을 중요합니다.

zebrafish의 유충이 감염 연구를위한 독특하고 다양한 척추 호스트를 제공합니다. 개발 zebrafish 애벌레의 첫 30 일 동안에만 타고난 면역 방어 2, 19-21는 타고난 면역력에 크게 의존 전파 칸디다 증과 같은 질병의 연구를 단순화합니다. zebrafish 애벌레의 작은 크기와 투명성은 모두 호스트 및 병원체에 대한 세포 수준에서 감염 역학 이미징을 가능하게합니다. 타고난 면역 세포를 fluorescing있는 유전자 변형 애벌레는 감염 22-24에 관련된 특정 세포 유형을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 수정된 안티 센스 oligonucleotides (Morpholinos)은 같은 식세포 NADPH 산화 효소 등 다양한 면역 요소를 허물고 funga에 대한 응답으로 변화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다난 감염 5. 작은 낮은 척추를 사용하는 윤리적하고 실용적인 장점 이외에도, zebrafish 애벌레 이미지 모두 intravitally와 색상의 병원체와 호스트 간의 총력전을에 독특한 기능을 제공한다.

zebrafish는 인간 병원성 박테리아의 여러 모델 감염에 사용되었으며, mycobacterial 감염 3 25 우리의 이해에 큰 발전의 수단이되었습니다. 단, 최근에 이러한 유충 5를 감염하는 데 사용되었습니다 진균류, 23, 26, 훨씬 더 많은 병원체를 가지고 있고, 감염 방법에 대한 자세한 영상 설명도 없어 데이트. 여기에서 우리는 이전 프로토콜에 대한 우리의 수정을 포함하여 꼼꼼한 25 zebrafish의 hindbrain의 뇌실의 microinjection을 위해 우리의 기술을 소개합니다. 곰팡이 감염 애벌레 zebrafish 모델을 사용하여 우리의 연구 결과는 체외 연구에서에서 갈리는과 호스트 병원체 intera 검사의 필요성을 강화오히려 배양 접시 5 간소화 시스템보다 호스트의 복잡한 환경에서 ction.

Protocol

모든 zebrafish 관리 프로토콜 및 실험 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 프로토콜 A2009-11-01하에 수행되었다. 1. Morpholino와 애벌레 사출 요리 실험 기간 : * (10-15분) 어려움의 정도 : * 달걀 주사 들어, 멸균 물, 전자렌지에 2 % 아가로 오스 솔루션을 준비합니다. 그것의 반을 가득 때까지 솔루션은 별도…

Discussion

여기서 제시 zebrafish microinjection 방법은 Gutzman 외 다릅니다. 34 저 여기에 우리가 36-48 hpf의 애벌레의 hindbrain의 뇌실에 귀의 소포를 통해 주사를 보여줍니다. 우리가 설명하는 방법은 감소 조직 손상과 hindbrain의 꽂혔어 10-15 효모의 일관된 주입을 허용합니다. 이 프로토콜은 24 hpi (그림 1)과 상당한 주죠 / 병적 5의 결과에 의해 신체 전반에 걸쳐 펼쳐지는 초기에 현…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 장비의 배아 개발 및 사용 속도에 조언을 microinjection 교육, 고모 헨리 박사 캐롤 김 연구실 감사드립니다, 그리고 fli1 기여에 대한 나단 로손과 같습니다 EGFP 생선. 우리는 원고의 비판적 읽기를 위해 윌러 연구소와 션의 성벽의 회원 감사드립니다. 우리는 또한이 프로젝트에 대한 기술적 조언 생선 관심과 조언을 마크 Nilan, 그리고 라이언 Phennicie와 크리스틴 가보 감사드립니다. 이 작품은 K. 형제, MAFES 해치 기금 E08913-08, 그리고 R. 휠러에 대한 NIH NCRR 보너스 P20RR016463에 MAFES 연구 assistantship에 의해 재정 지원되었다.

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments (optional)
Spawning tanks Aquatic habitats  2L  
1.7 mL tubes Axygen MCT-175-C
Instant Ocean Fisher Scientific S17957C  
Extra deep Petri dishes Fisher Scientific 08-757-11Z  
Standard Petri dishes VWR Scientific 25384-302
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M  
Yeast Extract VWR Scientific 90000-726  
Peptone VWR Scientific 90000-264  
Dextrose Fisher Scientific D16-1  
Agar VWR Scientific 90000-760  
Disposable Hemocytometer VWR Scientific 82030-468  
Phosphate Buffered Saline VWR Scientific 12001-986  
Dumont Dumoxel Tweezers VWR Scientific 100501-806  
Wooden Dowels VWR Scientific 10805-018
KimWipes VWR Scientific 300053-964
Low Melt Agarose VWR Scientific 12001-722  
Agarose for injection dishes VWR Scientific 12002-102
Flaming Brown Micropipette Puller Sutter Instruments P-97
Hollow glass rods Sutter Instruments BF120-69-10 For glass rods smooth glass by heating over bunsen burner 
Pipette Storage Box Sutter Instruments BX10
MPPI-3 Injection system Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
Back Pressure Unit Applied Scientific Instrumentation BPU  
Micropipette Holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP  
Foot Switch Applied Scientific Instrumentation FSW  
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33  
Magnetic Base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base  
Tricaine methane sulfonate Western Chemical Inc. MS-222  
Dissecting Scope Olympus SZ61 top SZX-ILLB2-100 base  
Confocal Microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system  
TC-7 Tissue Culture Roller drum with 14 inch test tube wheel New Brunswick Scientific  TC-7  
Imaging Dishes MatTek Corporation P24G-1.0-10-F  
Pipette tips for loading needles Eppendorf 930001007  
Plate pouring grids Adaptive Science Tools TU-1
Heated Stage Bioptechs Inc. Delta T-5
Flat Spatula VWR Scientific 82027-486
Plastic Sieves Wares of Knutsford Online 12 cm
Parafilm VWR Scientific 52858-000
Vortex Genie VWR Scientific 14216-184
16 x 150 mm Culture tubes VWR Scientific 60825-435
Nanodrop Thermo Scientific ND 2000
Phenol Red VWR Scientific 97062-478
HCl VWR Scientific 87003-216
NaCl VWR Scientific BDH4534-500GP
KCl VWR Scientific BDH4532-500GP
MgSO4 VWR Scientific BDH0246-500GP
Ca(NO3)2 VWR Scientific BDH0226-500GP
HEPES VWR Scientific BDH4520-500GP
Morpholinos GeneTools, LLC
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References

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Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051, doi:10.3791/4051 (2012).
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