Summary

Voorbereiding van Acute subventriculaire zone Schijfjes voor Calcium Imaging

Published: September 19, 2012
doi:

Summary

Werkwijze voor subventriculaire zone (SVZ) cellen geladen met calcium indicator kleurstoffen voor opname calcium activiteit beschreven. De postnatale SVZ bevat dicht opeengepakte cellen met inbegrip van neurale progenitor cellen en neuroblasten. Plaats van bad loading injecteerden we de kleurstof door druk in het weefsel voor een beter kleurstofdiffusieoverdracht.

Abstract

De subventriculaire zone (SVZ) is een van de twee neurogene zones in de postnatale hersenen. De SVZ bevat dicht op elkaar gepakte cellen, met inbegrip van neurale progenitorcellen met astrocytaire functies (de zogenaamde SVZ astrocyten), neuroblasten, en tussenliggende progenitorcellen. Neuroblasten geboren in de SVZ tangentiaal migreren een grote afstand tot de bulbus olfactorius, waar ze differentiëren tot interneuronen. Intercellulaire signalering door middel van adhesiemoleculen en diffundeerbare signalen spelen een belangrijke rol bij het beheersen van neurogenese. Veel van deze signalen te activeren intercellulaire calcium activiteit die informatie binnen en tussen cellen verzendt. Calcium activiteit is dus representatief voor de activiteit van extracellulaire signalen en is optimaal aan functionele intercellulaire signalering tussen SVZ cellen te begrijpen.

Calcium activiteit is bestudeerd in veel andere gebieden en celtypen, waaronder rijpe astrocyten en neuronen. De traditionele methode load cellen met calcium indicator kleurstof (dwz bad laden) was niet efficiënt bij het ​​laden alle SVZ celtypen. Inderdaad, de celdichtheid in de SVZ sluit kleurstofdiffusie in het weefsel. Bovendien zal bereiden sagittale plakken beter behoud van de driedimensionale schikking van SVZ cellen, met name de stroom neuroblast migratie de rostrale-caudale as.

Hier beschrijven we methoden om sagittale secties waarin de SVZ, het laden van SVZ cellen met calcium indicator kleurstof, en de overname van calcium activiteit met time-lapse filmpjes te bereiden. We gebruikten Fluo-4 AM kleurstof voor het laden van SVZ astrocyten met behulp van druk toepassing binnen het weefsel. Calcium activiteit werd opgenomen met behulp van een scanning confocale microscoop zodat een nauwkeurige resolutie voor het onderscheiden van afzonderlijke cellen. Onze aanpak toepasbaar is op andere neurogene zones zoals de hippocampus volwassen en embryonale subgranulaire zone neurogene zones. Ook andere typen kleurstoffen kunnenworden toegepast met de beschreven werkwijze.

Protocol

1. Bereiding van oplossingen, Dissection en Vibratome Oplossingen worden bereid op de juiste osmolariteit en pH (tabel 1). Vergeleken met kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) wordt dissectie oplossing bereid met lagere concentraties van natrium en calcium, en de concentratie van magnesium. Dit is om excitotoxiciteit effecten te minimaliseren tijdens het snijden. Zowel dissectie en ACSF oplossingen worden verzadigd met 95% O2 / 5% CO 2 borrelen ten minste…

Discussion

Calcium beeldvorming van SVZ cellen is om patronen te bestuderen in spontane activiteit in neuroblasten 10 receptor kanaal expressie in zowel neuroblasten en astrocyten 4,6,8 en astrocytaire calcium golven 3. Omdat cellen in de SVZ zijn ofwel onrijp of gliale eigenschappen, ze niet ontslaan actiepotentialen 11,12, wat betekent dat milliseconde veranderingen in spanningspotentiaal indicatie van de activiteiten in volwassen netwerken niet van toepassing is in deze regio. Daarom,…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (DC007681, AB), CT Stem Cell subsidie ​​(AB), Pardee stichting (AB), Predoctoraal Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards (NRSA) (SZY), en een NSF Graduate Research Fellowship (BL). Wij danken de Bordey lab leden voor nuttige commentaar op het manuscript. De huidige materiaal is gebaseerd op het werk mede ondersteund door de staat Connecticut in de Connecticut Stem Cell Research Grants Program. De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de officiële standpunten van de staat Connecticut, het ministerie van Volksgezondheid van de staat Connecticut of CT Innovations, Incorporated.

Materials

Solute Company Catalog Number Dissection (mM)
Sucrose Sigma S0389 Dissection: 147 mM
ACSF: 0 mM
NaCl Sigma S9888 Dissection: 42 mM
ACSF: 126 mM
KCl Sigma P3911 Dissection: 2.5 mM
ACSF: 2.5 mM
MgCl2.6H2O Sigma M9272 Dissection: 4.33 mM
ACSF: 1 mM
NaH2PO4.H2O Sigma S8282 Dissection: 1.25 mM
ACSF: 1.25 mM
Glucose Sigma G8270 Dissection: 10 mM
ACSF: 10 mM
NaHCO3 Sigma S6014 Dissection: 26 mM
ACSF: 26 mM
CaCl2.2H2O Sigma C3306 Dissection: 1.33 mM
ACSF: 2 mM

Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF.

      [header]
Name Company Catalogue Number Comments
Vibratome Leica VT 1000S  
Super Glue Surehold or 3M Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond  
Dissection tools Roboz or Ted Pella    
Fluo-4 AM calcium-sensitive dye Invitrogen F14201  
Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye Invitrogen O6807  
Pluronic F-127 20% solution in DMSO Invitrogen P3000MP  
Upright confocal microscope Olympus FV300 or FV1000  
Water-immersion objectives Olympus LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90)  
Micromanipulators Sutter MPC-200/MPC-325/MPC-385  
Pressure controller Parker Hannifin Picospritzer <3 PSI during application
Pipette puller Sutter or Narshige Sutter P-97 or Narshige PP-830  
Glass pipettes Sutter BF150-110-10 I.D.:1.10, O.D.: 1.50
Peristaltic pump Harvard Apparatus Model 720 flow rate: 1 ml/min
Chamber bath Warner Instruments RC-26 GLP Low profile allows for objective clearance
Tubing Tygon    
Temperature Controller Warner Instruments TC-324B/344B  

Table 2. Materials/equipment list.

References

  1. Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).
  2. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).
  3. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells. Eur. J. Neurosci. , (2011).
  4. Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
  5. Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis. Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).
  6. Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels. Front. Cell. Neurosci. 4, 8 (2010).
  7. Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
  8. Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone. J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).
  9. Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
  10. Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain. , (2007).
  11. Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes. Glia. 54, 394-410 (2006).
  12. Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ. J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).
  13. Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
  14. Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators. Science. 333, 1888-1891 (2011).
  15. Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).

Play Video

Citer Cet Article
Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J., Bordey, A. Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging. J. Vis. Exp. (67), e4071, doi:10.3791/4071 (2012).

View Video