Обработка первичной опухолевой ткани мозга для стволовых клеток Анализы и поток Сортировка
Summary
Выявление опухоли головного мозга начала клеток (BTICs), редкие клетки в гетерогенной опухоли, обладающих свойствами стволовых клеток, обеспечивает новому взглянуть на человека патогенезе опухоли головного мозга. Мы усовершенствовали конкретных условиях культуры для обогащения BTICs, и мы обычно используют проточной цитометрии для дальнейшего обогащения этих групп населения. Самообновление Анализы и расшифровка анализа одной ячейки RT-PCR впоследствии могут быть выполнены на этих изолированных клеток.
Abstract
Опухоли головного мозга, как правило, состоят из морфологически различных клеток, которые выражают различные нейронные маркеры линии. Лишь относительно небольшая часть клеток в опухоли со свойствами стволовых клеток, называемых опухолей головного мозга начала клеток (BTICs), обладают способностью дифференцироваться по нескольким линиям, самообновлению и инициировать опухолей в естественных условиях. Мы обратились условий культивирования первоначально использовались для нормальных нервных стволовых клеток (НСК) на различные человеческие опухоли головного мозга и обнаружили, что эта культура метод специально выбирает для стволовых как и население. Бессывороточной среде (NSC) позволяет для поддержания недифференцированного состояния стволовых клеток, а также добавление шФРФ и EGF позволяет за распространение нескольких мощных, самообновлению, и расширяемой tumorspheres.
Для дальнейшего характеризуют BTIC населения каждой опухоли, мы оцениваем маркеры клеточной поверхности с помощью проточной цитометрии. Мы также можем разобраться населения, представляющие интерес для более конкретных характеризующихчения. Самообновление анализы выполняются на одном BTICs сортируются в 96-луночные планшеты, формирование tumorspheres после инкубации при температуре 37 ° C указывает на присутствие стволовых клеток-предшественников или. Несколько номеров клетки частности населением также может быть отсортирован в разных скважин для ограничения разведения анализ, анализ самообновления мощности. Мы также можем изучить дифференциальное выражение гена в определенной популяции клеток с помощью одной ячейки RT-PCR.
Следующие протоколы описывают наши процедуры для диссоциации и культивирования первичных человеческих образцов для обогащения BTIC населения, а также диссоциация tumorspheres. Кроме того, включены протоколы для окрашивания для анализа потока цитометрии и сортировки, самообновлению анализы, и одна ячейка RT-PCR.
Introduction
Опухоли головного мозга являются одними из самых агрессивных и гетерогенных рака известна в людях. Хотя их раннего выявления и диагностики были способствовать современных нейро-технологий визуализации, мы все еще не имеют лечебных терапий для многих опухолей головного мозга, в частности, для диффузных, инвазивные те, или те, которые расположены в глубине мозга.
Опухоли головного мозга представляют ведущей причиной смертности от рака у детей в связи с их крайне агрессивно и часто неизлечимые природы. Глиобластомы (GBM), наиболее распространенные первичные опухоли головного мозга у взрослых, является одной из наиболее агрессивных злокачественных опухолей человека, опасается за свою равномерно роковой прогноз 1. Это очень злокачественная опухоль астроцитов (ВОЗ степень 4) обычно происходит в полушариях головного мозга у взрослых, а также может возникнуть у маленьких детей и младенцев. Его рост является быстрым и инфильтративных и диагностики патологических функции включают в себя ядерный плеоморфизм, капиллярная пролиферация и некрозы 2,3. Для AdulTS с недавно диагностированной глиобластомой, медиана выживаемости редко выходит за пределы 12 месяцев, 1, в целом плохо ответы на все терапевтические методы. Мы отметили, что существует множество функциональных и генетических сходств разделяет соматических стволовых клеток и раковых клеток, и что молекулярные пути, которые регулируют нормальное развитие мозга часто дизрегуляции в рак. При применении стволовых парадигм биологии клетки к изучению опухолей головного мозга, мы были первыми исследователями перспективно идентифицировать и очистить субпопуляции клеток из человеческих GBMS которые выставлены стволовых клеток свойствами распространения, самообновления и дифференцировки в пробирке 4 и в естественных условиях 5. Мы обратились условий культивирования и анализов первоначально использовались для характеристики нормальных нервных стволовых клеток (НСК) в пробирке 6,7 до нескольких детей и взрослых опухоли головного мозга, и обогащенные для этих стволовых клеток, подобных по мобильному сортировки для нервной маркер на поверхности клеток предшественников CD133 8 ,9. CD133 + опухоль головного мозга фракция содержала клетки, которые имели гораздо более высокую частоту раковых клеток, чем CD133-фракции в NOD-SCID мышей мозг 5,10. Это официально установлено, что только в редких подмножество мозге опухолевых клеток со свойствами стволовых клеток опухоли инициирования, зарабатывая их название "опухоль мозга начала клеток" или "BTICs". Роман идентификации BTICs обеспечивает новому взглянуть на человеческое опухолей головного мозга, давая сильную поддержку для клетки раковых стволовых гипотезу 10-13 в качестве основы для многих солидных опухолях, и устанавливает новый сотовый мишенью для более эффективных методов лечения рака 14-20. Терапия, направленные на убийство большую часть опухоли может пропустить редкие стволовые как фракции, позволяя опухоль продолжает расти. Терапия, направленные на убийство раковых клеток стволовые может обеспечить лучшее лечение и прогноз для пациентов с опухолями головного мозга.
С целью изучения BTIC населения, мы усовершенствовали нашу cultuповторно протоколов конкретно выбрать для клеточных популяций в человеческих опухолях головного мозга, которые обладают свойствами стволовых клеток. Бессывороточной, нейронные стволовые клетки (НСК) среды позволяет для поддержания недифференцированного состояния стволовых клеток, а кроме основного фактора роста фибробластов (шФРФ), эпидермальный фактор роста (EGF), и лейкемия ингибирующего фактора (LIF) позволяет распространение нескольких мощных, самообновлению, и расширяемой человека tumorspheres. Здесь мы описываем методы, участвующих в обработке первичных опухолей головного мозга и культивирования их в среде НСК для обогащения BTIC населения. Мы назвали нашу экспериментальную модель системы "BTIC изолятов пациентов", чтобы подчеркнуть тот факт, что эти клетки лишь в минимальной степени культивируют в стволовые ячейку условия, чтобы выбрать для населения стволовых клеток. Последующие immunolabelling из BTIC населения по ключевым стволовых клеток маркеры, такие как CD133 и CD15 и анализа проточной цитометрии также описан. Затем мы обсудим предельного разбавления анализа,которая помогает в изучении самообновления потенциал BTICs. Наконец, мы исследуем анализ экспрессии генов этих редких клеток сортировки одиночных камерах на AmpliGrid слайдов и выполнение одной ячейке RT-PCR. Эти методы применимы также к другим опухоли головного мозга, таких как медуллобластомой, эпендимома и детских глиомы.
Protocol
Discussion
Раковой клетки стволовые гипотеза 10, по работе в лейкозом 21, рак молочной железы 11 и раком мозга 4,5, показывает, что лишь сравнительно небольшая часть клеток в опухоли, называемые раковые стволовые клетки, обладающие способностью широко распространяться и самост…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Онтарио Института исследования рака (OICR), Terry Fox Foundation и Американской ассоциации нейрохирургов.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 1:1 DMEM:F12 | Invitrogen | 11320-082 |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 |
| 1M HEPES | Wisent | 330-050-EL |
| Glucose | Invitrogen | 15023-021 |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165-25g |
| Neural survival factor -1 (NSF-1) | Lonza Clonetics | CC-4323 |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | PHG0261 |
| Leukemia inhibitory factor (LIF) | Millipore | LIF1010 |
| Antibiotic/mycotic | Wisent | 450-115-EL |
| Liberase TM | Roche | 05 401 119 001 |
| Ammonium chloride solution | Stem Cell Technologies | 07850 |
References
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Epidemiology and etiology of gliomas. Acta Neuropathol. 109, 93 (2005).
- Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma. 10, 319 (2010).
- Wechsler-Reya, R., Scott, M. P. The developmental biology of brain tumors. Annu. Rev. Neurosci. 24, 385 (2001).
- Singh, S. K. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 63, 5821 (2003).
- Singh, S. K. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396 (2004).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1 (1996).
- Tropepe, V. Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev. Biol. 208, 166 (1999).
- Yin, A. H. AC133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 90, 5002 (1997).
- Yu, Y., Flint, A., Dvorin, E. L., Bischoff, J. AC133-2, a novel isoform of human AC133 stem cell antigen. J. Biol. Chem. 277, 20711 (2002).
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105 (2001).
- Al-Hajj, M. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 3983 (2003).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. 3, 730 (1997).
- Matsui, W. Characterization of clonogenic multiple myeloma cells. Blood. 103, 2332 (2004).
- Bao, S. Targeting cancer stem cells through L1CAM suppresses glioma growth. Cancer Res. 68, 6043 (2008).
- Bao, S. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, 756 (2006).
- Bao, S. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 66, 7843 (2006).
- Beier, D. Temozolomide preferentially depletes cancer stem cells in glioblastoma. Cancer Res. 68, 5706 (2008).
- Piccirillo, S. G. Distinct pools of cancer stem-like cells coexist within human glioblastomas and display different tumorigenicity and independent genomic evolution. Oncogene. 28, 1807 (2009).
- Piccirillo, S. G. morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444, 761 (2006).
- Rich, J. N., Bao, S. Chemotherapy and cancer stem cells. Cell Stem Cell. 1, 353 (2007).
- Lapidot, T. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367, 645 (1994).
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105 (2001).
- Fuchs, E., Segre, J. A. Stem cells: a new lease on life. Cell. 100, 143 (2000).
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157 (2000).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707 (1992).
- Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12, 4565 (1992).
- Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science. 166, 747 (1969).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495 (1975).
- Barrett, L. E. Self-renewal does not predict tumor growth potential in mouse models of high-grade glioma. Cancer Cell. 21, 11 (2012).
- Venugopal, C. Bmi1 marks intermediate precursors during differentiation of human brain tumor initiating cells. Stem Cell Res. 8, 141 (2012).
- Gerlinger, M. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883 (2012).
- Gilbertson, R. J. Medulloblastoma: signalling a change in treatment. Lancet. Oncol. 5, 209 (2004).
- Zhu, Y., Parada, L. F. The molecular and genetic basis of neurological tumours. Nat. Rev. Cancer. 2, 616 (2002).
- Maher, E. A. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15, 1311 (2001).
- Blake, W. J., KAErn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. Noise in eukaryotic gene expression. Nature. 422, 633 (2003).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, 1183 (2002).
- Maheshri, N., O’Shea, E. K. Living with noisy genes: how cells function reliably with inherent variability in gene expression. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 413 (2007).
- Raj, A. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4, e309 (2006).
- Ross, I. L., Browne, C. M., Hume, D. A. Transcription of individual genes in eukaryotic cells occurs randomly and infrequently. Immunol. Cell Biol. 72, 177 (1994).
- Kubista, M. The real-time polymerase chain reaction. Mol. Aspects Med. 27, 95 (2006).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1, 1559 (2006).
