Purificazione di Vacuoli patogeno da<em> Legionella</em>-Infetti fagociti
Summary
Questo articolo descrive un metodo per l'isolamento e la purificazione di intatto<em> Legionella</em> Contenenti vacuoli (LCV) da amebe e macrofagi. Le due fasi protocollo comprende arricchimento LCV mediante immuno-separazione magnetica utilizzando un anticorpo contro un marcatore batterica LCV e ulteriore purificazione mediante centrifugazione a gradiente di densità.
Abstract
L'agente patogeno opportunistico Legionella pneumophila è un ameba-batterio resistente, che replica anche nei macrofagi alveolari causando la grave polmonite "'malattia del legionario" 1. In fagociti protozoi e mammiferi, L. pneumophila si avvale di un meccanismo conservato in modo da formare uno specifico, la replica-permissive vano, la "Legionella contenente vacuolo" (LCV). Richiede la formazione di LCV batterica Icm / Dot sistema di secrezione di tipo IV (T4SS), che trasloca ben 275 "effettrici" proteine in cellule ospiti. Gli effettori manipolare proteine di accoglimento, nonché lipidi e comunicare con secretoria, organelli endosomiali e mitocondriale 2-4.
La formazione di veicoli commerciali leggeri rappresenta un processo complesso, robusto e ridondante, che è difficile da afferrare in maniera riduzionista. Un approccio integrato è necessario per comprendere esaurientemente la formazione di LCV, compresa un'analisi globale del percorsoplasminogeno interazioni ospite-fattori e le loro dinamiche temporali e spaziali. Come primo passo verso questo obiettivo, veicoli commerciali leggeri intatte vengono purificati e analizzati dalla proteomica e lipidomica.
La composizione e la formazione di patogeno contenenti vacuoli è stata studiata mediante analisi proteomica mediante cromatografia liquida o 2-D elettroforesi su gel accoppiato a spettrometria di massa. Vacuoli isolati sia dal suolo un'ameba sociale Dictyostelium discoideum o fagociti di mammifero ospitato Leishmania 5, 6 Listeria, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, 9 o Salmonella Legionella spp. Dieci. Tuttavia, i protocolli di purificazione impiegati in questi studi sono tempo e noiosa, in quanto richiedono ad esempio microscopia elettronica per analizzare morfologia LCV, l'integrità e purezza. Inoltre, questi protocolli non sfruttare le caratteristiche specifiche del vacuolo patogeno per l'enrichment.
Il metodo qui presentato supera queste limitazioni impiegando D. discoideum produrre un marcatore fluorescente LCV e prendendo di mira il SIDC batterica proteine effettrici, che selettivamente ancoraggio alla membrana LCV legandosi alla fosfatidilinositolo 4-fosfato (PtdIns (4) P) 3,11. LCV sono arricchite in una prima fase di immuno-separazione magnetica utilizzando un purificati per affinità anticorpo primario contro SIDC e un anticorpo secondario accoppiato a biglie magnetiche, seguita in una seconda fase dalla classica centrifugazione in gradiente di densità Histodenz 12,13 (Fig. 1) .
Uno studio del proteoma di veicoli commerciali leggeri isolati dal D. discoideum rivelato più di 560 proteine della cellula ospite, comprese le proteine associate con vescicole fagocitica, mitocondri, ER e Golgi, nonché GTPasi diversi, che non sono stati implicati nella formazione LCV prima 13. LCV arricchito e purificato con ilprotocollo descritto qui può essere ulteriormente analizzati al microscopio (immunofluorescenza, microscopia elettronica), metodi biochimici (Western Blot) e gli approcci di proteomica o lipidomic.
Protocol
Discussion
In contrasto con i metodi pubblicati in precedenza, questo protocollo si basa su due fasi, prima la separazione dei veicoli commerciali leggeri da parte di un approccio immuno-magnetico, e la seconda, la purificazione dei veicoli commerciali leggeri di centrifugazione in gradiente di densità. L'isolamento LCV può essere facilmente seguita da microscopia a fluorescenza, quando sia i batteri fluorescente GFP e cellule produttrici di anticorpi o di colorazione viene utilizzato. Il protocollo qui descritto è un sempl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca nel nostro laboratorio è stato sostenuto dalla Max von Pettenkofer Institute, Ludwig-Maximilians University di Monaco di Baviera, il tedesco Research Foundation (DFG, HI 1511/3-1) e il Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) iniziativa "Infezione Medical Genomics" ( 0315834C).
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