培養大人の背根神経節ニューロンの軸索再生の遺伝学的研究
Summary
不定冠詞<em> in vitroで</em培養された成体マウス後根神経節ニューロンを用いた軸索再生の遺伝学的研究のために>モデルが記載されています。方法は、遺伝子操作を受けているニューロンから軸索の再成長を可能にするre-suspension/re-platingステップを含む。このアプローチは、RNAiベースのタンパク質のノックダウンを使用して、軸索再生の機能喪失研究のために特に便利です。
Abstract
それはよく、中枢神経系（CNS）の成熟したニューロンが成熟した中枢神経系の1,2軸索の成長と敵対的な環境をサポートするために減少した固有の能力に起因する負傷した後に軸索を再生成することができないことが知られている。対照的に、末梢神経系（PNS）の成熟したニューロンが傷害3の後に容易に再生成します。成人後根神経節（DRG）ニューロンはよく末梢神経損傷後、確実に再生することが知られています。周辺ターゲットと脊髄に延びる中央の分岐を支配末梢枝：各DRGニューロンは細胞体から、どの枝2軸索の枝に1軸索を成長します。実質的な軸索再生におけるDRGの末梢軸索結果の損傷は、脊髄の中心的な軸索のに対し、損傷後の不十分な再生成します。末梢軸索損傷は、脊髄損傷（プロセスがコンディショニング病変と呼ばれる）、中央の軸索の再生の前に発生した場合は、greatlです。yは4を改善しました 。また、DRGニューロンの中央の軸索は、脊髄での皮質脊髄軸索を降順同じ敵対的な環境を共有しています。一緒に、それは大人のDRGニューロンの軸索再生を制御する分子メカニズムは中枢神経系の軸索再生を向上させるために利用することができると仮定されています。その結果、成人DRGニューロンは、現在広く再生軸索成長5-7研究するモデル系として使用されています。
ここでは、in vitroでの軸索再生の遺伝学的研究に使用することができる大人のDRGニューロンの培養方法について説明します。このモデルでは、成人DRGニューロンは遺伝的にエレクトロポレーションによる遺伝子トランスフェクション6,8を介して操作されます。 DNAプラスミドまたはSI / shRNAを、このアプローチは大人のDRGニューロンからの軸索成長の任意の目的遺伝子の役割を調べるために、両方のゲインおよび機能喪失実験を可能にすると神経細胞をトランスフェクトすることにより。ニューロンは、SI / shRNAをトランスフェクトされると、対象となる内因性のタンパク質である通常あまり効果的で機能喪失の検討を進め、強固な軸索の成長が既に発生しているその間に、培養中の3-4日後の枯渇。この問題を解決するために、ここで説明する方法では、軸索が標的タンパク質の存在下でニューロンから再成長することができますトランスフェクション後の再懸濁および再メッキステップが含まれています。最後に、我々は成人DRGニューロンの9時から軸索成長を媒介する軸索再生関連遺伝子、c-Junの、の役割を研究するためにin vitroモデルでこれを使用する例を提供しています。
Protocol
Discussion
大人のDRGニューロンはこうして大人の動物では軸索の再生を研究するために有用なシステムを提供し、確実にin vivo及び in vitro における末梢神経損傷後に軸索を再生成します。大人のDRGニューロンのin vitro培養の分子メカニズムを調べるために広く使われている方式になってきているから軸索再生が規制されています。培養成体マウスDRGニューロンの in vitro の</em…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH（R01NS064288）とクレイグ·H.ニールセン財団からFZへの補助金によって支えられている。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 |
| Anti–βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
References
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration. Annu. Rev. Neurosci. , (2010).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23, 83-91 (1999).
- Liu, R. Y., Snider, W. D. Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth. J. Neurosci. 21, RC164 (2001).
- Zhou, F. Q. Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism. J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).
- Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons. J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).
- Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC. Neuron. 42, 897-912 (2004).
- Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).
- Costigan, M. Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury. BMC Neurosci. 3, 16 (2002).
- Xiao, H. S. Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).
- Michaelevski, I. Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response. Sci. Signal. 3, ra53 (2010).
