Estudo genético da regeneração do axônio com cultivadas Adulto neurônios do gânglio da raiz dorsal

Summary

Um<em> In vitro</em> Modelo para o estudo genético de regeneração do axônio usando cultivadas adultos do mouse dorsal neurônios do gânglio da raiz é descrito. O método inclui um passo re-suspension/re-plating para permitir re-crescimento axonal a partir de neurónios submetidos a manipulação genética. Esta abordagem é especialmente útil para a perda de função de estudos de regeneração axonal utilizando RNAi baseado knockdown proteína.

Abstract

É bem conhecido que os neurónios maduros no sistema nervoso central (CNS) não pode regenerar os seus axónios após lesões devido a capacidade intrínseca diminuída para suportar o crescimento axonal e um ambiente hostil no CNS ^1,2 madura. Em contraste, os neurónios maduros no sistema nervoso periférico (PNS) regenerar rapidamente após lesões ^3. Adultos gânglio da raiz dorsal (DRG) neurónios são bem conhecidos para regenerar vigorosamente após lesões dos nervos periféricos. Cada neurônio DRG cresce um axônio da célula soma, que se divide em dois ramos: um ramo do axônio periférico inervação alvos periféricos e um ramo central se estende para a medula espinhal. Lesão dos DRG resultados periféricos axônios em regeneração do axônio substancial, enquanto os axônios centrais na medula espinhal regenerar mal após a lesão. No entanto, se a lesão periférica axonal ocorre antes da lesão da medula espinal (um processo denominado a lesão condicionado), a regeneração de axónios centrais é greatly melhorado ^4. Além disso, os axónios dos neurónios centrais DRG partilham o mesmo ambiente hostil como decrescente axónios corticoespinhais na medula espinal. Juntos, é a hipótese de que os mecanismos moleculares que controlam a regeneração do axônio dos neurônios adultos DRG pode ser aproveitado para melhorar a regeneração do axônio do SNC. Como resultado, os neurónios DRG adultos são agora largamente utilizado como um sistema modelo para estudar o crescimento axonal regenerativo ^5-7.

Aqui, descrevemos um método de cultura adulto neurónio de DRG que pode ser usado para o estudo genético de regeneração axonal in vitro. Neste modelo adulto neurônios DRG são geneticamente manipulados por meio de eletroporação transfecção mediada gene ^6,8. Por transfecção de neurônios com DNA plasmídeo ou SI / shRNA, esta abordagem permite que as duas de ganho e perda de função de experimentos para investigar o papel de qualquer gene de interesse no crescimento do axônio dos neurônios DRG adultos. Quando os neurónios são transfectadas com SI / shRNA, a proteína endógena é orientadageralmente empobrecido após 3-4 dias em cultura, tempo durante o qual o crescimento axonal robusto já tenha ocorrido, tornando os estudos de perda de função-menos eficaz. Para resolver este problema, o método aqui descrito inclui um passo re-suspensão e re-plating após a transfecção, o que permite axónios de voltar a crescer a partir de neurónios na ausência da proteína alvo. Finalmente, fornecemos um exemplo da utilização deste modelo de vitro para estudar o papel de um gene axónio regeneração-associado, c-Jun, na mediação crescimento axonal de adulto DRG neurónios ^9.

Protocol

1. Preparação de Lamelas, meio de cultura, e as enzimas da digestão A rodada de 12 mm # 1 lamelas de vidro são usados ​​para a cultura neuronal. As lamelas são limpos com 10% de HCL durante a noite seguido por lavagem de ultra-sons com água destilada e desionizada por 3 vezes (20 minutos / hora). As lamelas limpos são armazenados em etanol a 70% para uso futuro. Antes de cada experimento, as lamelas são secos ao ar e colocado na placa de cultura. Para revestir as lamelas secos, 100 ul de…

Discussion

Neurónios DRG adultos regenerar os seus axónios robustamente após a lesão do nervo periférico in vivo e de vitro, proporcionando assim um sistema útil para estudar a regeneração axonal em animais adultos. In vitro cultura de neurónios DRG adultos se está a tornar um método largamente utilizado para investigar os mecanismos moleculares pelos quais axônio regeneração é regulada. O procedimento de vitro de neurônios adultos cultura do mouse DRG aqui apresentada p…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
MEM	Invitrogen	11090-081
Poly-D-Lysine hydrobromide	Sigma -Aldrich	P6407
Laminin	Invitrogen	23017-015
5-fluoro-2-deoxyuridine	Sigma -Aldrich	F0503
Uridine	Sigma -Aldrich	U3003
Collagenase A	Roche	10103578001
TrypLE Express	Invitrogen	12604-013
Fetal bovine serum	Invitrogen	10270-098
Penicillin-streptomycin (100X)	Invitrogen	15140-122
GlutaMAX-I (100X)	Invitrogen	35050-038
Glass coverslips (#1)	Electron Microscopy sciences	72196-12
24 well cell culture plate	Becton Dickinson	35-3047
1X PBS	Mediatech	21-040-CV
Sterile, distilled and deionized water	Mediatech	25-055-CV
Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons	Lonza	VPG-1001
ON-TARGETplus siRNA against c-Jun	Dharmacon	L-043776
Anti–βIII tubulin antibody (Tuj-1)	Covance	MMS-435P
ProLong Gold Antifade mounting solution	Invitrogen	P36930