培养成年的背根神经节神经元轴突再生的遗传研究
Summary
一个<em>在体外</em用培养的成年小鼠背根神经节神经元的轴突再生的遗传研究模型描述。方法包括re-suspension/re-plating的步骤，允许进行遗传操作的神经元的轴突重新生长。这种做法是轴突再生功能丧失使用RNAi为基础的蛋白质击倒的研究特别有用。
Abstract
这是众所周知的，成熟的神经元在中枢神经系统（CNS）不能再生它们的轴突受伤后，由于减少的内在能力，以支持在1,2成熟的中枢神经系统轴突生长和充满敌意的环境。相比之下，在成熟的神经元周围神经系统（PNS）的再生容易受伤后3。成年猫背根神经节（DRG）神经元是众所周知的有力周围神经损伤后再生。每背根神经节神经元增长1轴突从胞体，分支成两个轴突分支：外围分支支配外围目标和中央部门，延伸到脊髓。损伤的背根神经节的末梢神经轴突大量的轴突再生的结果，而中央在脊髓轴突再生的受伤后不佳。但是，如果发生周围性轴索损伤脊髓损伤（这个过程被称为空调病变），中央轴突再生前是greatlŸ提高4。此外，中央DRG神经元轴突共享降皮质脊髓轴突充满敌意的环境。在一起，这是假设，控制成年DRG神经元的轴突再生的分子机制可以利用，以提高中枢神经系统轴突再生。因此，现在广泛使用的成人DRG神经元作为一个模型系统研究再生轴突生长5-7。
在这里，我们描述了一个成人，DRG神经元培养轴突再生的基因研究在体外可以使用的方法。在这个模型成年DRG神经元的基因通过电穿孔介导的基因转染6,8操纵。转染神经元的DNA质粒或SI / shRNA的，这种方法能够使增益和亏损的功能试验，以调查任何在成年DRG神经元的轴突生长的基因利益的作用。当神经元与SI / shRNA的转，有针对性的内源性蛋白通常耗尽后3-4天，在文化，在这期间，强大的轴突生长已经发生，减少损失的功能研究有效。为了解决这个问题，这里介绍的方法，包括一个染后的再悬浮和再镀步，使轴突从神经元的目标蛋白质的情况下重新长出。最后，我们利用体外模型研究轴突再生相关基因c-Jun的作用，在调解成年DRG神经元的轴突生长提供了一个例子。
Protocol
Discussion
成年DRG神经元在体内和体外的周围神经损伤后轴突再生强劲，从而提供了一个有用的系统研究在成年动物的神经轴突再生。成年DRG神经元在体外培养成为一种广泛使用的方法来研究的分子机制轴突再生的调节。 在体外培养成年小鼠DRG神经元的过程中所提出的在这里可以迅速和有效的再生轴突生长的遗传研究。再悬浮和再镀过程是亏损的功能研究特别有用，因为它允许轴…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
FZ型从NIH（R01NS064288）和克雷格H.尼尔森基金会的赠款，以支持这项工作。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 |
| Anti–βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
References
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration. Annu. Rev. Neurosci. , (2010).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23, 83-91 (1999).
- Liu, R. Y., Snider, W. D. Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth. J. Neurosci. 21, RC164 (2001).
- Zhou, F. Q. Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism. J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).
- Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons. J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).
- Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC. Neuron. 42, 897-912 (2004).
- Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).
- Costigan, M. Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury. BMC Neurosci. 3, 16 (2002).
- Xiao, H. S. Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).
- Michaelevski, I. Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response. Sci. Signal. 3, ra53 (2010).
