Genetisk Undersøgelse af Axon Regeneration med dyrkede voksne dorsale rodganglie neuroner
Summary
En<em> In vitro</em> Model for genetisk undersøgelse af axon regenerering ved hjælp af dyrkede voksne mus dorsale rodganglie-neuroner er beskrevet. Fremgangsmåden omfatter et re-suspension/re-plating trin for at tillade axon genvækst af neuroner under genetisk manipulation. Denne fremgangsmåde er især nyttig til tab-af-funktion undersøgelser af axon regenerering ved hjælp af RNAi-baserede protein knockdown.
Abstract
Det er velkendt, at modne neuroner i centralnervesystemet (CNS) ikke kan regenerere deres axoner efter skader på grund af formindsket iboende evne til at understøtte axon vækst og et fjendtligt miljø for det modne CNS 1,2. I modsætning hertil regenerere modne neuroner i det perifere nervesystem (PNS) let efter skader 3. Voksent dorsale rodganglie (DRG)-neuroner, er velkendte til at regenerere robust efter perifere nervebeskadigelser. Hver DRG neuron vokser en axon fra cellen Soma, der forgrener sig i to aksonal grene: en perifer gren innerverer perifere mål og en central gren strækker sig ind i rygmarven. Skade af DRG perifere axoner resulterer i væsentlig axon regenerering mens centrale axoner i rygmarven regenerere dårligt efter skaden. Hvis den perifere axonal skade forekommer før rygmarvsskade (en proces kaldet konditionering læsionen), regenerering af centrale axoner er greatly forbedret 4. Desuden centrale axoner i DRG-neuroner har samme fjendtlige miljø nedad corticospinal axoner i rygmarven. Sammen er det en hypotese, at de molekylære mekanismer, der styrer Axon regenerering af voksne DRG-neuroner kan udnyttes til at forbedre CNS Axon regenerering. Som et resultat heraf bliver voksne DRG-neuroner nu i vid udstrækning anvendt som et modelsystem til undersøgelse regenerativ axon vækst 5-7.
Her beskriver vi en fremgangsmåde til voksen DRG neuroner kultur, der kan anvendes til genetisk undersøgelse af axon regenerering in vitro. I denne model voksne DRG-neuroner, er genetisk manipulerede via elektroporation-medieret gentransfektion 6,8. Ved transfektion neuroner med DNA-plasmid eller Si / shRNA, er det muligt både gain-og tab af funktion eksperimenter for at undersøge den rolle som helst gen af interesse i axon vækst fra voksne DRG-neuroner. Når neuroner transficeres med Si / shRNA den målrettede endogene protein ersædvanligvis opbrugt efter 3-4 dage i kultur, hvorunder robust axon vækst allerede har fundet sted, hvilket gør tab-af-funktion undersøgelser mindre effektiv. For at løse dette problem, den her beskrevne fremgangsmåde indbefatter et resuspension og re-udpladning trin efter transfektion, hvilket giver axoner på ny vækst af neuroner i fravær af den tilsigtede protein. Endelig har vi et eksempel på anvendelse af denne in vitro-model til at studere rollen af en axon regenerering-associeret gen, c-Jun, i mediering axon vækst fra voksne DRG neuroner 9.
Protocol
Discussion
Voksent DRG-neuroner regenerere deres axoner robust efter perifer nerveskade in vivo og de vitro, hvilket giver et nyttigt system til at studere axon regenerering i voksne dyr. In vitro-dyrkning af voksne DRG-neuroner bliver en almindeligt anvendt metode til at undersøge de molekylære mekanismer, hvorved Axon regenerering reguleres. In vitro procedure til dyrkning af voksne mus DRG-neuroner præsenteret her muliggør hurtig og effektiv genetiske undersøgelse af regenerativ axon væ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud til FZ fra NIH (R01NS064288) og Craig H. Neilsen Foundation.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 |
| Anti–βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
References
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration. Annu. Rev. Neurosci. , (2010).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23, 83-91 (1999).
- Liu, R. Y., Snider, W. D. Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth. J. Neurosci. 21, RC164 (2001).
- Zhou, F. Q. Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism. J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).
- Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons. J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).
- Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC. Neuron. 42, 897-912 (2004).
- Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).
- Costigan, M. Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury. BMC Neurosci. 3, 16 (2002).
- Xiao, H. S. Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).
- Michaelevski, I. Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response. Sci. Signal. 3, ra53 (2010).
