Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen
Summary
Ein<em> In-vitro-</em> Modell für genetische Untersuchung von Axonregeneration mit kultivierten adulten Maus Spinalganglienneuronen beschrieben wird. Das Verfahren umfasst einen Schritt zur re-suspension/re-plating Axon Nachwachsen von Neuronen unterzogen genetische Manipulation zu ermöglichen. Dieser Ansatz ist besonders nützlich für die Loss-of-Funktions-Studien von Axonregeneration unter Verwendung von RNAi-basierten Protein Knockdown.
Abstract
Es ist bekannt, dass ausgereifte Nervenzellen im zentralen Nervensystem (ZNS) kann sich nicht regenerieren ihre Axone nach Verletzungen durch verminderte intrinsische Fähigkeit, das Wachstum der Axone und eine feindliche Umgebung in der reifen ZNS 1,2 zu unterstützen. Im Gegensatz dazu reifen Neuronen im peripheren Nervensystem (PNS) leicht nach Verletzungen regenerieren 3. Adult Spinalganglien (DRG) Neurone sind bekanntlich robust regenerieren nach peripheren Nervenverletzungen. Jede DRG Neuron wächst ein Axon aus der Zelle soma, die verzweigt sich in zwei Äste axonalen: ein peripheres Filiale innervieren peripheren Ziele und einen zentralen Zweig, der sich in das Rückenmark. Verletzung der DRG peripheren Axone führt zu erheblichen Axonregeneration, während zentraler Axone im Rückenmark schlecht regenerieren nach der Verletzung. Allerdings, wenn die periphere axonale Schädigung tritt vor der Verletzung des Rückenmarks (ein Prozess namens der Konditionierung Läsion), die Regeneration des zentralen Axone ist greatly verbesserte 4. Darüber hinaus teilen die zentralen Axone von DRG-Neuronen der gleichen feindlichen Umgebung wie absteigend corticospinaler Axone im Rückenmark. Gemeinsam wird die Hypothese aufgestellt, dass die molekularen Mechanismen, die Axonregeneration von erwachsenen DRG-Neuronen genutzt werden, um ZNS Axonregeneration zu verbessern. Als Ergebnis findet man adulte DRG-Neuronen heute weithin als Modellsystem zur Untersuchung der regenerativen Axonwachstum 7.5 verwendet.
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur adulten DRG Neuronenkultur, die für genetische Studien Axonregeneration in vitro verwendet werden können. In diesem Modell erwachsenen DRG-Neuronen sind genetisch mittels Elektroporation vermittelte Gentransfektion 6,8 manipuliert. Durch Transfektion von Neuronen mit DNA-Plasmid oder si / shRNA, ermöglicht dieser Ansatz sowohl Gewinn-und Verlust-of-function Experimente über die Rolle von jedem Gen-of-Interest in Axonwachstum aus adulten DRG-Neuronen zu untersuchen. Wenn Neuronen mit Si / shRNA transfiziert werden, ist die gezielte endogenes Proteinin der Regel nach 3-4 Tagen in der Kultur, während welcher Zeit robuste Wachstum der Axone bereits aufgetreten ist aufgebraucht, so dass die Loss-of-Funktions-Studien weniger wirksam. Um dieses Problem zu lösen, umfasst das hier beschriebene Verfahren eine Resuspension und Re-Plattierungsschritt nach der Transfektion, die Axone von Neuronen in der Abwesenheit des Zielproteins wieder wachsen können. Schließlich bieten wir ein Beispiel für die Verwendung dieser in-vitro-Modell, um die Rolle eines Axonregeneration-assoziierten Gens c-Jun, bei der Vermittlung Axonwachstum aus adulten DRG-Neuronen 9 zu studieren.
Protocol
Discussion
Adult DRG-Neuronen ihre Axone regenerieren robust nach peripheren Nervenverletzungen in vivo und in vitro, wodurch ein nützliches System zu Axonregeneration bei erwachsenen Tieren zu studieren. In-vitro-Kultur von adulten DRG-Neuronen wird immer eine weit verbreitete Methode, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, mit denen Axonregeneration geregelt wird. Die In-vitro-Verfahren zur Kultivierung von adulten Maus DRG-Neuronen hier vorgestellten ermöglicht eine schnelle und eff…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien an FZ vom NIH (R01NS064288) und der Craig H. Neilsen Stiftung unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 |
| Anti–βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
References
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