Genetisk studie av Axon Regeneration med dyrkede Voksen røttene ganglion Neurons

Summary

En<em> In vitro</em> Modell for genetisk undersøkelse av axon gjenfødelse bruke dyrkede voksne mus dorsal root ganglion nevroner er beskrevet. Metoden omfatter en re-suspension/re-plating skritt å tillate axon ettervekst fra nevroner som gjennomgår genetisk manipulasjon. Denne tilnærmingen er særlig nyttig for tap-av-funksjon studier av axon foryngelse med RNAi-baserte protein knockdown.

Abstract

Det er velkjent at modne nevroner i sentralnervesystemet (CNS) ikke kan regenerere sine aksoner etter skader på grunn av redusert egenverdi evne til å støtte axon vekst og et fiendtlig miljø i modne CNS ^1,2. I motsetning, modne nevroner i det perifere nervesystemet (PNS) regenerere lett etter skader ^3. Voksen dorsal root ganglion (DRG) nevronene er godt kjent for å regenerere robust etter perifere nerveskader. Hver DRG neuron vokser en axon fra cellen soma, som grener seg i to aksonale grener: en perifer gren innervating perifere mål og en sentral avdelingskontorer strekker i ryggmargen. Skade av DRG perifere aksoner resulterer i betydelig axon gjenfødelse, mens sentrale axoner i ryggmargen regenerere dårlig etter skaden. Men hvis perifere aksonal skade inntreffer før den ryggmargsskade (en prosess kalt condition lesjon), regenerering av sentrale axoner er greatly forbedret ^fire. Videre de sentrale axons av DRG nevroner som deler samme fiendtlig miljø som synkende corticospinal axoner i ryggmargen. Sammen blir det en hypotese at de molekylære mekanismene som styrer axon regenerering av voksne DRG nevroner kan bli brukt til å forbedre CNS axon gjenfødelse. Som et resultat, er voksne DRG nevroner nå mye brukt som et modellsystem for å studere regenerative axon vekst ^5-7.

Her beskriver vi en metode for voksen DRG nervecellen kultur som kan brukes til genetisk undersøkelse av axon regenerering in vitro. I denne modellen voksen DRG nevroner er genetisk manipulert via electroporation-mediert genet transfeksjon ^6,8. Ved transfecting nevroner med DNA plasmid eller si / shRNA, gjør denne tilnærmingen både gevinst-og tap-av-funksjon eksperimenter for å undersøke hvilken rolle en gen-of-interesse i axon vekst fra voksne DRG nerveceller. Når nevroner tilført med Si / shRNA, er målrettet endogene proteinetvanligvis oppbrukt etter 3-4 dager i kultur, der tiden robust axon veksten allerede har skjedd, noe som gjør tap-av-funksjon studier mindre effektiv. For å løse dette problemet, omfatter metoden beskrevet her en re-suspensjon og re-plating steg etter transfeksjon, som lar axons å re-vokse fra nevroner i fravær av den målrettede protein. Til slutt gir vi et eksempel på bruk denne in vitro modell for å studere rollen til en axon gjenfødelse-assosiert genet, c-Jun, i formidling axon vekst fra voksen DRG nerveceller ^9.

Protocol

1. Utarbeidelse av Dekkglass, Kultur Medium, og fordøyelse enzymer Den 12-mm runde # 1 glass Dekkglass brukes for nevronale kultur. De Dekkglass rengjøres med 10% HCl natten etterfulgt av ultralyd vask med destillert og avionisert vann for 3 ganger (20 min / tid). De rensede Dekkglass lagres i 70% etanol for fremtidig bruk. Før hver eksperimenter, Dekkglass er luft tørket og plassert inn i kulturen plate. Å belegge de tørkede Dekkglass, 100 mL av belegg løsning som inneholder 100 mikrogram / …

Discussion

Voksen DRG nevroner regenerere sine axoner robust etter perifer nerveskade in vivo og in vitro, og dermed gi et nyttig system for å studere axon regenerering hos voksne dyr. In vitro kultur av voksne DRG nevroner er blitt en mye brukt metode for å undersøke de molekylære mekanismer som axon gjenfødelse er regulert. In vitro prosedyren for dyrking voksne mus DRG nevroner presenteres her muliggjør rask og effektiv genetisk studie av regenerativ axon vekst. Det re-suspensjon og re-…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
MEM	Invitrogen	11090-081
Poly-D-Lysine hydrobromide	Sigma -Aldrich	P6407
Laminin	Invitrogen	23017-015
5-fluoro-2-deoxyuridine	Sigma -Aldrich	F0503
Uridine	Sigma -Aldrich	U3003
Collagenase A	Roche	10103578001
TrypLE Express	Invitrogen	12604-013
Fetal bovine serum	Invitrogen	10270-098
Penicillin-streptomycin (100X)	Invitrogen	15140-122
GlutaMAX-I (100X)	Invitrogen	35050-038
Glass coverslips (#1)	Electron Microscopy sciences	72196-12
24 well cell culture plate	Becton Dickinson	35-3047
1X PBS	Mediatech	21-040-CV
Sterile, distilled and deionized water	Mediatech	25-055-CV
Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons	Lonza	VPG-1001
ON-TARGETplus siRNA against c-Jun	Dharmacon	L-043776
Anti–βIII tubulin antibody (Tuj-1)	Covance	MMS-435P
ProLong Gold Antifade mounting solution	Invitrogen	P36930