Генетическое изучение регенерации аксонов с искусственного взрослых нейронов ганглиев
Summary
<em> В пробирке</em> Модель для генетических исследований регенерации аксона использование культурного взрослой мыши нейронов ганглия корень описано. Метод включает в себя re-suspension/re-plating шаг, чтобы аксона возобновления роста от нейронов проходят генетических манипуляций. Этот подход особенно полезен для потерей функции исследования регенерации аксона использованием РНК-интерференции на основе белка нокдаун.
Abstract
Хорошо известно, что зрелые нейроны в центральной нервной системе (ЦНС), не может восстановить свои аксоны после травмы в связи со снижением внутреннего способность поддерживать рост аксонов и враждебной среде, в зрелом 1,2 ЦНС. В отличие от зрелых нейронов в периферической нервной системы (ПНС) легко восстанавливать после травм 3. Взрослые спинномозговых ганглиев (DRG) нейронов хорошо известны надежно восстанавливать после повреждений периферических нервов. Каждый нейрон DRG растет один аксон из клетки сомы, которая разделяется на две ветви аксонального: периферические ветви, иннервирующие периферический цели и центральный филиал распространяются на спинной мозг. Травмы периферических DRG результаты аксонов в регенерации аксона существенное, в то время как центральные аксоны в спинной мозг восстанавливает плохо после травмы. Однако, если периферическое аксонального повреждения происходит до травмы спинного мозга (этот процесс называется кондиционирования поражения), регенерацию аксонов центральной greatlу улучшилось 4. Кроме того, центральные аксоны DRG нейроны одни и те же враждебном окружении как убыванию кортикоспинальных аксонов в спинном мозге. Вместе, он предположил, что молекулярные механизмы, контролирующие регенерацию аксонов взрослых нейронов DRG могут быть использованы для повышения ЦНС Аксон регенерации. В результате взрослые нейроны DRG настоящее время широко используются в качестве модельной системы для изучения восстановительного роста аксонов 5-7.
Здесь мы опишем метод взрослых DRG нейрона культуры, которая может быть использована для генетического исследования регенерации аксонов в пробирке. В этой модели для взрослых DRG нейронов генетически модифицированных с помощью электропорации опосредованной трансфекции гена 6,8. По трансфекции нейронов с ДНК плазмиды или Si / ShRNA, такой подход позволяет как усиление и потерей функции экспериментов по исследованию роли любого гена интересов, в аксон роста у взрослых нейронов DRG. Когда нейроны трансфицированных Si / ShRNA, целевой белок является эндогеннымОбычно обедненного через 3-4 дня в области культуры, во время которых высокие темпы роста аксонов уже произошло, в результате чего с потерей функциональных исследований менее эффективными. Чтобы решить эту проблему, метод, описанный здесь, включает в себя повторное приостановление и повторное покрытие шаг после трансфекции, которая позволяет аксонам повторно вырастить из нейронов в отсутствие целевого белка. Наконец, мы приведем пример использования этой модели в пробирке для изучения роли аксона регенерации связанных генов, с-Jun, в качестве посредника аксона роста у взрослых DRG нейронов 9.
Protocol
Discussion
Взрослые нейронов DRG восстановить свои аксоны решительно после повреждения периферического нерва в естественных условиях и в пробирке, обеспечивая тем самым полезную для изучения регенерации аксонов у взрослых животных. В пробирке культуру взрослых нейронов DRG станови…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами в ФЗ от NIH (R01NS064288) и Крейг Г. Нильсен Foundation.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 |
| Anti–βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
References
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration. Annu. Rev. Neurosci. , (2010).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23, 83-91 (1999).
- Liu, R. Y., Snider, W. D. Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth. J. Neurosci. 21, RC164 (2001).
- Zhou, F. Q. Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism. J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).
- Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons. J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).
- Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC. Neuron. 42, 897-912 (2004).
- Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).
- Costigan, M. Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury. BMC Neurosci. 3, 16 (2002).
- Xiao, H. S. Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).
- Michaelevski, I. Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response. Sci. Signal. 3, ra53 (2010).
