Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal

Summary

Un<em> In vitro</em> Modelo para el estudio genético de la regeneración axonal utilizando cultivos de neuronas de ratones adultos ganglio de la raíz dorsal se describe. El método incluye un paso para permitir re-suspension/re-plating axón re-crecimiento de las neuronas se someten a la manipulación genética. Este enfoque es especialmente útil para los estudios de pérdida de la función de regeneración axonal utilizando RNAi basado en caída proteína.

Abstract

Es bien sabido que las neuronas maduras en el sistema nervioso central (SNC) no se puede regenerar sus axones después de lesiones debidas a la capacidad disminuida intrínseca para apoyar el crecimiento axonal y un ambiente hostil en el ^1,2 SNC maduro. En contraste, las neuronas maduras en el sistema nervioso periférico (PNS) regenerar fácilmente después de las lesiones ^3. XXX raíz dorsal (DRG ganglionares) neuronas son bien conocidos para regenerar robustamente después de lesiones de nervios periféricos. Cada neurona DRG crece un axón del soma celular, que se ramifica en dos ramas: una rama axonal periférico que inerva objetivos periféricos y una rama central que se extiende a la médula espinal. Lesiones de los resultados DRG axones periféricos en la regeneración de axones sustancial, mientras que los axones centrales en la médula espinal regenerarse poco después de la lesión. Sin embargo, si la lesión axonal periférica se produce antes de la lesión de la médula espinal (un proceso llamado la lesión acondicionado), la regeneración de los axones centrales es greatly mejora ^4. Por otra parte, los axones de las neuronas DRG centrales comparten el mismo ambiente hostil como descendente corticoespinal axones en la médula espinal. En conjunto, es la hipótesis de que los mecanismos moleculares que controlan la regeneración de los axones de las neuronas DRG adultos pueden aprovecharse para mejorar la regeneración del SNC axón. Como resultado, adultos neuronas DRG se utilizan ahora ampliamente como un sistema modelo para estudiar el crecimiento axonal regenerativo ^5-7.

Aquí se describe un método de cultivo adulto DRG neurona que puede ser utilizado para el estudio genético de la regeneración axonal de vitro. En este ejemplo de un adulto las neuronas DRG están genéticamente manipulados a través de electroporación mediada por transfección de genes ^6,8. Al transfectar neuronas con ADN plásmido o si / shRNA, este enfoque permite a ambos ganancia y la pérdida de la función de los experimentos para investigar el papel de un gen de interés en el crecimiento de los axones de las neuronas DRG adultos. Cuando las neuronas son transfectadas con SI / shRNA, la proteína endógena es dirigidageneralmente agotada después de 3-4 días en cultivo, durante el cual el crecimiento del axón tiempo robusta ya ha ocurrido, por lo que los estudios de pérdida de la función sea menos eficaz. Para resolver este problema, el método aquí descrito incluye un paso de re-suspensión y re-chapado después de la transfección, que permite que los axones para volver a crecer a partir de las neuronas en la ausencia de la proteína específica. Por último, ofrecemos un ejemplo del uso de este modelo in vitro para estudiar el papel de una regeneración axonal asociada a la genética, c-Jun, en la mediación de crecimiento de los axones de las neuronas DRG adultos ^9.

Protocol

1. Preparación de cubreobjetos, medio de cultivo, y las enzimas de digestión La ronda 12-mm # 1 cubreobjetos de vidrio se utilizan para el cultivo neuronal. Los cubreobjetos se limpian con HCl al 10% durante la noche seguido por lavado ultrasónico con agua destilada y desionizada durante 3 veces (20 minutos / hora). Los cubreobjetos limpios se almacena en 70% de etanol para uso futuro. Antes de cada experimentos, los cubreobjetos se secan al aire y se coloca en la placa de cultivo. Para recubrir …

Discussion

Adultos DRG neuronas regeneren sus axones firmeza después de la lesión del nervio periférico in vivo e de vitro, lo que proporciona un sistema útil para estudiar la regeneración de axones en los animales adultos. El cultivo in vitro de los adultos las neuronas DRG se está convirtiendo en un método ampliamente utilizado para investigar los mecanismos moleculares por los cuales la regeneración del axón está regulado. El procedimiento de vitro de neuronas de c…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
MEM	Invitrogen	11090-081
Poly-D-Lysine hydrobromide	Sigma -Aldrich	P6407
Laminin	Invitrogen	23017-015
5-fluoro-2-deoxyuridine	Sigma -Aldrich	F0503
Uridine	Sigma -Aldrich	U3003
Collagenase A	Roche	10103578001
TrypLE Express	Invitrogen	12604-013
Fetal bovine serum	Invitrogen	10270-098
Penicillin-streptomycin (100X)	Invitrogen	15140-122
GlutaMAX-I (100X)	Invitrogen	35050-038
Glass coverslips (#1)	Electron Microscopy sciences	72196-12
24 well cell culture plate	Becton Dickinson	35-3047
1X PBS	Mediatech	21-040-CV
Sterile, distilled and deionized water	Mediatech	25-055-CV
Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons	Lonza	VPG-1001
ON-TARGETplus siRNA against c-Jun	Dharmacon	L-043776
Anti–βIII tubulin antibody (Tuj-1)	Covance	MMS-435P
ProLong Gold Antifade mounting solution	Invitrogen	P36930