Genetisk studie av Axon Regeneration med odlade Vuxna Mjukstrålar neuroner rotganglion
Summary
En<em> In vitro</em> Modell för genetisk studie av axonregeneration använda odlade vuxna mus dorsala nervceller rotganglion beskrivs. Metoden innefattar ett steg re-suspension/re-plating att tillåta axonet återtillväxten av neuroner som genomgår genetisk manipulering. Detta tillvägagångssätt är särskilt användbart för förlust av funktion studier av Axon förnyelse med RNAi-baserade protein knockdown.
Abstract
Det är välkänt att mogna neuroner i det centrala nervsystemet (CNS) kan inte regenereras sina axoner efter skador på grund av minskad inneboende förmåga att stödja tillväxt av axon och en fientlig miljö i den mogna CNS 1,2. I motsats härtill mogna neuroner i det perifera nervsystemet (PNS) regenerera lätt efter skador 3. Vuxna dorsala rotganglion (DRG)-neuroner är väl kända för att regenerera kraftigt efter perifera nervskador. Varje DRG neuron växer en axonet från cellen Soma, som grenar i två axonala grenar: en perifer gren innerverar perifera mål och en central gren sträcker sig in i ryggmärgen. Skador av DRG perifera axoner resulterar i betydande Axon förnyelse, medan centrala axoner i ryggmärgen återskapa dåligt efter skadan. Om emellertid den perifera axonal skada inträffar före den ryggmärgsskada (en process som kallas den konditionerande lesionen), regenerering av centrala axoner är greatly förbättras 4. Vidare är de centrala axoner av DRG-neuroner har samma fientlig miljö som fallande kortikospinala axoner i ryggmärgen. Tillsammans är det hypotesen att de molekylära mekanismer som styr axon nybildning av vuxna DRG nervceller kan utnyttjas för att öka CNS Axon regeneration. Som ett resultat, är vuxna DRG-neuroner nu i stor omfattning som ett modellsystem för att studera regenerativ axontillväxt 5-7.
Här beskriver vi en metod för vuxna DRG neuroner kultur som kan användas för genetisk undersökning av axonregeneration in vitro. I denna modell vuxna DRG-neuroner är genetiskt manipulerade via elektroporering-medierad gen transfektion 6,8. Genom transfektion neuroner med DNA-plasmid eller Si / shRNA, möjliggör detta tillvägagångssätt både förstärknings-och förlust-av-funktionsmutationer experiment för att undersöka rollen av vilken gen som helst av intresse i axontillväxt från vuxna DRG-neuroner. När neuroner transfekteras med Si / shRNA är riktad endogena proteinetoftast slut efter 3-4 dagar i kultur, under vilken tid robust axontillväxt redan inträffat, vilket gör förlust av funktion studier mindre effektiv. För att lösa detta problem innefattar den här beskrivna metoden en resuspension och åter pläteringssteget efter transfektion, vilket tillåter axoner att åter växa från neuroner i frånvaro av den riktade proteinet. Slutligen, tillhandahåller vi ett exempel på användning av denna in vitro modell för att studera rollen av en axonregeneration-associerade genen, c-Jun, vid mediering axontillväxt från vuxen DRG-neuroner 9.
Protocol
Discussion
Vuxna DRG nervceller förnya sina axoner kraftigt efter perifer nervskada in vivo och in vitro, vilket ger ett användbart system för att studera axonregeneration hos vuxna djur. In vitro-odling av vuxna DRG nervceller blir en allmänt använd metod för att undersöka de molekylära mekanismer genom vilka Axon förnyelse regleras. In vitro-förfarande mus odla vuxna DRG nervceller som presenteras här möjliggör snabb och effektiv genetisk studie av regenerativ Axon tillväxt. Resu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag till FZ från NIH (R01NS064288) och Craig H. Neilsen Foundation.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 |
| Anti–βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
References
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration. Annu. Rev. Neurosci. , (2010).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23, 83-91 (1999).
- Liu, R. Y., Snider, W. D. Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth. J. Neurosci. 21, RC164 (2001).
- Zhou, F. Q. Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism. J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).
- Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons. J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).
- Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC. Neuron. 42, 897-912 (2004).
- Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).
- Costigan, M. Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury. BMC Neurosci. 3, 16 (2002).
- Xiao, H. S. Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).
- Michaelevski, I. Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response. Sci. Signal. 3, ra53 (2010).
