En fremgangsmåde til stor skala oprensning af APP intracellulære domæne (AICD) er beskrevet. Vi beskriver også metoder til at fremkalde<em> In vitro</em> AICD sammenlægning og visualisering ved atomic force mikroskopi. De beskrevne fremgangsmåder er nyttige til biokemiske / strukturel karakterisering af AICD og virkningerne af molekylære chaperoner på dens aggregering.
Amyloidprecursorprotein (APP) er et type I transmembrant protein associeret med patogenesen af Alzheimers sygdom (AD). APP er kendetegnet ved et stort ekstracellulært domæne og en kort cytosolisk domæne kaldet APP intracellulære domæne (AICD). Under modning gennem den sekretoriske sti, kan APP spaltes af proteaser kaldet α, β, og γ-sekretaser 1. Sekventiel proteolytisk spaltning af APP med β-og γ-sekretaser fører til produktion af en lille proteolytisk peptid, betegnet Ap, som er amyloidogene og kernen bestanddel af senile plaques. The AICD er også frigøres fra membranen efter sekretasebearbejdning, og gennem interaktioner med Fe65 og Tip60, kan translokere til kernen for at deltage i transskriptionsregulering af flere målgener 2,3. Protein-protein interaktioner, der involverer AICD kan påvirke handelen, forarbejdning og cellulære funktioner i holo-APP og dets C-terminal-fragmenter. Vi har for nylig vist, at AICD kan aggregere in vitro, og denne fremgangsmåde inhiberes af AD-impliceret molekylchaperone ubiquilin-1 4. I overensstemmelse med disse resultater har AICD eksponerede hydrofobe domæner og er uløseligt uorden in vitro 5,6, men det opnår en stabil sekundær struktur, når det er bundet til Fe65 7. Vi har foreslået at ubiquilin-1 forhindrer uhensigtsmæssige inter-og intramolekylære interaktioner af AICD, forhindrer aggregering in vitro og i intakte celler 4. Mens de fleste undersøgelser fokuserer på den rolle APP i patogenesen af AD, hvilken rolle AICD i denne proces er ikke klar. Ekspression af AICD er blevet vist at inducere apoptose 8, til at modulere signaleringsveje 9, og at regulere calcium signalering 10. Over-ekspression af AICD og Fe65 i en transgen musemodel inducerer Alzheimers som patologi 11, og for nylig AICD er blevet påvist i brai lysater ved Western blotting, når du bruger passende antigen hentning teknikker 12. For at lette strukturelle, biokemiske og biofysiske undersøgelser af AICD, har vi udviklet en fremgangsmåde til fremstilling af rekombinant store mængder yderst rent AICD protein. Vi beskriver yderligere en fremgangsmåde til induktion af in vitro termiske aggregering af AICD og analyse ved atomic force mikroskopi. De beskrevne fremgangsmåder er nyttige til biokemiske, biofysiske og strukturelle karakterisering af AICD og virkningerne af molekylære chaperoner til AICD aggregering.
I denne protokol har vi skitseret en procedure for opnåelse af yderst ren AICD for strukturelle, biofysik, og biokemiske analyser. Denne procedure kræver ikke sofistikeret chromatografi udstyr og er derfor tilgængelig for de fleste laboratorier. Andre grupper har oprenset AICD 5-7,16, herunder GST-AICD 17-19, for biokemiske / strukturelle analyser. Ulemper til tidligere protokoller omfatter dårlig opløselighed af AICD 16, mindre end ideel renhed 17, og kravet om størrels…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dr. Hui Zheng (Baylor College of Medicine) for APP cDNA. Dette arbejde blev finansieret af NIH tilskud R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), John Sealy Memorial Endowment Fund for Biomedical Research (AFO) og Jean C. og William D. Willis Neuroscience Research Endowment (ESS). JMB er en lærd i Translationel Forskning Scholar Program og et medlem fra University of Texas Medical Branch Claude E. Pepper Ældre amerikanere Independence Center (støttet af NIH Tilskud UL1RR029876 og P30-AG-024.832, henholdsvis).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |