Zuivering en Aggregatie van het amyloïde voorlopereiwit intracellulaire domein
Summary
Werkwijze voor grootschalige zuivering van het APP intracellulaire domein (AICD) beschreven. We beschrijven ook de methodologie voor het induceren<em> In vitro</em> AICD aggregatie en visualisatie van atomaire kracht microscopie. De beschreven methoden zijn nuttig voor biochemische / structurele karakterisering van de AICD en de effecten van moleculaire chaperones op de aggregatie.
Abstract
Amyloïde voorlopereiwit (APP) is een type I transmembraan eiwit geassocieerd met de pathogenese van de ziekte van Alzheimer (AD). APP wordt gekenmerkt door een groot extracellulair domein en een korte cytosolische domein zogenaamde APP intracellulaire domein (AICD). Tijdens rijping door de secretieroute kan APP worden gesplitst door proteasen genoemd α, β, γ-en secretasen 1. Sequentiële proteolytische splitsing van APP met β en γ-secretasen leidt tot de productie van een kleine proteolytische peptide, aangeduid Aß, dat amyloidogene en de kern bestanddeel van seniele plaques. De AICD is bevrijd van het membraan na secretase verwerking en via interacties met Fe65 en Tip60 kan naar de kern om aan transcriptie regulatie van meerdere doelgenen 2,3. Eiwit-eiwit interacties waarbij AICD kunnen beïnvloeden handel, verwerking en cellulaire functies van holo-APP en C-terminal fragmenten. We hebben onlangs aangetoond dat AICD kan totaal in vitro, en dit proces wordt geremd door de AD-betrokken moleculaire chaperonne ubiquilin-1 4. Consistent met deze bevindingen de AICD hydrofobe domeinen heeft belicht en intrinsiek ongeordend in vitro 5,6, maar het verkrijgt stabiele secundaire structuur wanneer gebonden aan Fe65 7. We hebben voorgesteld ubiquilin-1 ongepast inter-en intramoleculaire interacties van AICD voorkomt, waardoor aggregatie in vitro en in intacte cellen 4. Terwijl de meeste studies richten zich op de rol van APP in de pathogenese van AD, de rol van de AICD in dit proces is niet duidelijk. Expressie van AICD is aangetoond dat apoptose induceren 8, te moduleren signaalwegen 9, en calcium reguleren signalering 10. Over-expressie van AICD en Fe65 in een transgeen muismodel induceert Alzheimer pathologie zoals 11 en onlangs AICD is gedetecteerd in brain lysaten door western blotting, wanneer er gebruik geschikte antigeen retrieval technieken 12. Structurele, biochemische en biofysische studies van AICD vergemakkelijken, hebben we een procedure om recombinant grote hoeveelheden zeer zuivere eiwit AICD. We beschrijven verder een werkwijze voor het induceren van de in vitro aggregatie van thermische analyse door AICD en atomic force microscopie. De beschreven methoden zijn nuttig voor biochemische, biofysische en structurele karakterisering van de AICD en de effecten van moleculaire chaperones op AICD aggregatie.
Protocol
Discussion
In dit protocol hebben we geschetst van een procedure voor het verkrijgen van zeer zuivere AICD om structurele, biofysische en biochemische analyses. Deze procedure vereist geen geavanceerde chromatografie apparatuur en is daarom toegankelijk voor de meeste laboratoria. Andere groepen hebben gezuiverd AICD 5-7,16, met inbegrip van GST-AICD 17-19, voor de biochemische / structurele analyses. Nadelen naar de vorige protocollen zijn: een slechte oplosbaarheid van AICD 16, minder dan ideaal …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Dr Hui Zheng (Baylor College of Medicine) bedanken voor de APP cDNA. Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), de John Sealy Memorial Endowment Fonds voor biomedisch onderzoek (AFO), en de Jean C. en William D. Willis Neuroscience Research Endowment (ESS). JMB is een geleerde in de Translationeel Onderzoek Scholar Program en een lid van de Universiteit van Texas Medical Branch Claude E. Pepper Oudere Amerikanen Independence Center (ondersteund door NIH subsidies UL1RR029876 en P30-AG-024832, respectievelijk).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
| Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
| Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
| IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
| Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
| Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
| Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
| AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
| WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |
References
- De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease. Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).
- Chang, K. A., Suh, Y. H. Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein. BMB reports. 43, 656-663 (2010).
- McLoughlin, D. M., Miller, C. C. The FE65 proteins and Alzheimer’s disease. J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).
- Stieren, E. S. Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein. J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).
- Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR. J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).
- Ramelot, T. A., Gentile, L. N. Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors. Biochem. 39, 2714-2725 (2000).
- Radzimanowski, J. Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2. EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).
- Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis. Gene. 475, 1-9 (2011).
- von Rotz, R. C. The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor. J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).
- Hamid, R. Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content. J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).
- Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation. PLoS ONE. 5, e11866 (2010).
- Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. Detection of APP intracellular domain in brain tissue. Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).
- Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein. Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).
- Hansma, H. G. Recent advances in atomic force microscopy of DNA. Scanning. 15, 296-299 (1993).
- Valbuena, A. Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy. Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).
- Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain. Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).
- Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).
- Kim, M. Y. Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk. J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).
- Lazarov, O. Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited. J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).
- Kakuda, N. Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase. J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).
- Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. Amyloid under the atomic force microscope. Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).
