Метод крупномасштабной очистки APP внутриклеточного домена (AICD) описывается. Мы также описать методологию, чтобы побудить<em> В пробирке</em> AICD агрегирования и визуализации атомно-силовой микроскопии. Описанные методы могут быть использованы для биохимических / структурных характеристик AICD и последствия молекулярных шаперонов на его агрегации.
Белка-предшественника амилоида (APP) представляет собой трансмембранный типа я белка, связанного с патогенезом болезни Альцгеймера (AD). APP характеризуется большой внеклеточный домен и короткий цитозольного домена называется APP внутриклеточного домена (AICD). Во время созревания через секреторный путь, APP могут расщепляться протеазами называется α, β, γ и-секретазы 1. Последовательное протеолитического расщепления APP с β и γ-секретазы приводит к образованию небольшого пептида протеолитические, называется Ар, который является амилоидогенных и основной составляющей старческих бляшек. AICD также освобожден от мембраны после обработки секретазы, и через взаимодействие с Fe65 и Tip60, можно перемещать в ядро участвовать в регуляции транскрипции нескольких генов-мишеней 2,3. Белок-белковые взаимодействия, связанные с AICD могут повлиять на торговлю, обработку и клеточных функций голо-APP и C-терминологиюАль-фрагментов. Недавно мы показали, что AICD можете совокупности в пробирке, и этот процесс тормозится AD-замешан молекулярного шаперона ubiquilin-1 4. В соответствии с этими выводами, AICD выявила гидрофобных доменов, и внутренне неупорядоченным в пробирке 5,6, однако он получает стабильную вторичную структуру при связывании с Fe65 7. Мы предположили, что ubiquilin-1 предотвращает нарушение меж-и внутримолекулярных взаимодействий AICD, предотвращая агрегацию в пробирке и в неповрежденные клетки 4. Хотя большинство исследований сосредоточена на роли АЭС в патогенезе БА, роль AICD в этом процессе не ясно. Выражение AICD было показано, индуцируют апоптоз 8, для модуляции сигнальных путей, 9 и регулировать кальция сигнализации 10. Сверхэкспрессия AICD и Fe65 в трансгенных мышах вызывает болезнь Альцгеймера, как патология 11, а в последнее время AICD был обнаружен в бюстгальтерВ лизатов с помощью вестерн-блоттинга при использовании соответствующего антигена поиска методов 12. Для облегчения структурных, биохимических и биофизических исследований AICD, мы разработали процедуру для получения рекомбинантных большого количества очень чистой AICD белка. Мы также описать способ индуцирования в пробирке тепловой агрегации AICD и анализ атомно-силовой микроскопии. Методы, описанные полезны для биохимических, биофизических и структурных характеристик AICD и последствия молекулярных шаперонов на AICD агрегации.
В этом протоколе мы наметили порядок получения особо чистой AICD для структурных, биофизических и биохимических анализов. Эта процедура не требует сложного оборудования хроматографии и, следовательно, доступными для большинства лабораторий. Другие группы, очистив AICD 5-7,16, в том чи?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Хуэй Чжэн (Медицинского колледжа Бэйлора) для APP кДНК. Эта работа финансировалась грантами NIH R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (АФК), Джон Сили мемориальный благотворительный фонд для биомедицинских исследований (АФК), и Жан С. и Уильяма Д. Уиллис Neuroscience исследований фонда (ESS). JMB является ученым в Поступательное Программа научный сотрудник и член Техасском университете Медицинского отделения Клод Пеппер пожилых американцев Независимости центра (при поддержке грантов NIH UL1RR029876 и P30-AG-024 832, соответственно).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |