High-throughput Screening niedermolekularer Modulatoren von Inward Gleichrichter-Kaliumkanäle
Summary
Verfahren zum Entwickeln und Validieren eines quantitativen Fluoreszenz-Assay zur Messung der Aktivität von Kalium Einwärtsgleichrichter (KIR) Kanäle für das Hochdurchsatz-Screening Verbindung wird vorgestellt.
Abstract
Bestimmte Mitglieder der Einwärtsgleichrichter Kalium (Kir) Kanal Familie drug targets für eine Vielzahl von Erkrankungen, einschließlich Bluthochdruck, Vorhofflimmern und Schmerzen 1,2 postuliert. Zum größten Teil jedoch Fortschritte zum Verständnis ihres therapeutischen Potenzials oder sogar grundlegenden physiologischen Funktionen durch den Mangel an guten pharmakologischen Werkzeugen verlangsamt. In der Tat hat die molekulare Pharmakologie des Einwärtsgleichrichter Familie weit hinter der des S4 Superfamilie der spannungsgesteuerten Kaliumkanäle (Kv)-Kanäle, für die eine Reihe von nanomolaren-Affinität und hochselektive Peptidtoxin Modulatoren 3 entdeckt haben zurückgeblieben. Die Bienengift Toxin tertiapin und seine Derivate sind potente Inhibitoren von Kir1.1 und Kir3 Kanäle 4,5, aber Peptide sind nur von begrenztem Nutzen therapeutisch als auch experimentell aufgrund ihrer antigenen Eigenschaften und schlechte Bioverfügbarkeit, metabolische Stabilität und Gewebe Penetranz. Die Entwicklung potenterund selektive niedermolekulare Sonden mit verbesserten pharmakologischen Eigenschaften werden ein Schlüsselfaktor für ein volles Verständnis der Physiologie und therapeutische Potenzial von Kir-Kanälen sein.
Das Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) durch die National Institutes of Health (NIH) Common Fund hat Möglichkeiten geschaffen für akademische Wissenschaftler Sonde Entdeckung Kampagnen für molekulare Targets und Signalwege in der Notwendigkeit einer besseren pharmakologischen 6 einzuleiten. Die MLPCN bietet Forschern den Zugang zu Industrie-scale Screening-Zentren und die medizinische Chemie und Informatik zu unterstützen niedermolekularen Sonden, um die Funktion von Genen und Gen-Netzwerke aufzuklären entwickeln. Der entscheidende Schritt in der Zulassung zu dem MLPCN ist die Entwicklung eines robusten Target-oder Pathway-spezifischen Assay, zugänglich für High-Throughput-Screening (HTS) ist.
Hier beschreiben wir, wie man eine Fluoreszenz-basierten Thallium (Tl +) flux assa entwickelny von Kir Kanalfunktion für das Hochdurchsatz-Screening Verbindung 7,8,9,10. Der Assay basiert auf der Durchlässigkeit des K +-Kanals Pore der K + Kongener Tl + basiert. Eine handelsübliche Leuchtstofflampen Tl + Reporter-Farbstoff wird verwendet, um transmembrane Fluss der Tl + durch die Pore zu erkennen. Es gibt mindestens drei kommerziell erhältliche Farbstoffe, die sich für Tl + Flux Assays sind: BTC, FluoZin-2 und 7,8 Fluxor. Dieses Protokoll beschreibt Assay-Entwicklung mit FluoZin-2. Obwohl ursprünglich entwickelt und vermarktet als Zink-Indikator, Ausstellungen FluoZin-2 eine robuste und dosisabhängige Erhöhung der Fluoreszenzemission auf Tl + Bindung. Wir begann mit FluoZin-2 vor Fluxor verfügbar war 7,8 und haben weiterhin so 9,10 zu tun. Jedoch sind die Schritte in Assay-Entwicklung im wesentlichen identisch für alle drei Farbstoffe, und Benutzer sollten bestimmen, welche am besten geeigneten Farbstoff ist für ihre spezifische nEEDS. Wir diskutieren auch die Assays Performance-Benchmarks, die erreicht, um für die Einreise in die MLPCN in Betracht gezogen werden muss. Da Tl + gut durchzieht die meisten K +-Kanäle, sollte der Test sein, anpassbar an die meisten K +-Kanal Ziele.
Protocol
Representative Results
Discussion
Datenverarbeitung: Sobald die Daten gesammelt werden, ein gemeinsamer Schritt in der Analyse beinhaltet Normalisierung jedes Brunnens Fluoreszenz-Antwort, F, auf den Ausgangswert zu Beginn des Experiments, F 0. Dies wird allgemein als der "statische Verhältnis" bezeichnet und symbolisiert "F / F 0". In Fällen, in denen F 0 von der Indikatorfarbstoff dominiert wird die statische Verhältnis Operation wird im wesentlichen für viele Faktore…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Mittel aus National Institutes of Health Zuschüsse 1R21NS073097-01 und 1R01DK082884 (JSD) und der Stiftung für den National Institutes Gewährung PIER11VCTR unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| pcDNA5/TO | Invitrogen | V1033-20 | Tetracycline-inducible expression vector |
| T-REx-HEK293 cells | Invitrogen | R71007 | Tetracycline-inducible cell line |
| Lipofectamine LTX/Plus Reagent | Invitrogen | 15338100 | Transfection reagent |
| FBS | ATLANTA Biologicals | S11550 | Cell culture media |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | Cell culture media |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | Cell culture media |
| Blasticidin S | Invitrogen | R210-01 | Cell culture media |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | Cell culture media |
| HBSS-divalent free | Mediatech | 21022CV | Cell washing |
| Trypsin-0.25% | Mediatech | 25053CI | Cell dissociation |
| Tetracycline-HCl | Sigma | T9823 | Induction reagent |
| Dialyzed FBS | ATLANTA Biologicals | S12650 | Plating media |
| FluoZin-2 | Invitrogen | F24189 | Fluorescent dye |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P-3000MP | Dye loading |
| HBSS | Invitrogen | 14175 | Assay buffer |
| HEPES | Invitrogen | 15630 | Assay buffer |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Tl+ stimulus buffer |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | Tl+ stimulus buffer |
| CaSO4•2H2O | Sigma | C3771 | Tl+ stimulus buffer |
| D-Glucose | Sigma | G7528 | Tl+ stimulus buffer |
| Thallium sulfate | Aldrich | 204625 | Tl+ stimulus buffer |
| HEPES | Sigma | H4034 | Tl+ stimulus buffer |
| DMSO | Sigma | D4540 | Solvent |
| Eight-channel electronic pipettor | Biohit | E300 | Cell plating in 384-well plates |
| BD PureCoat amine-coated 384-well plates | BD Biosciences | 356719 | Assay microplates |
| Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP) | Labcyte | P-05525 | Compound source microplates |
| 384-well polypropylene microplates | Greiner Bio-One | 781280 | |
| Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| ELx405 microplate washer | BioTek | ELx405HT | Automated cell washing |
| Echo liquid handler | Labcyte | Labcyte Echo 550 | |
| Bravo automated liquid handling platform | Agilent Technologies | Standard model | |
| Hamamatsu FDSS 6000 | Hamamatsu | Kinetic imaging plate reader |
Table 1. List of Materials and Reagents.
References
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