Сотовые конкретного анализа<em> Arabidopsis</em> Листья Использование флуоресценции клеток, активированных Сортировка

Summary

Способ получения<em> Arabidopsis</em> Лист протопласты, которые совместимы с флуоресценции активирован сортировки клеток (FACS), что позволяет для исследования конкретных клеточных популяций. Этот метод совместим с любой<em> Arabidopsis</em> Линия, которая выражает GFP в подмножество клеток.

Abstract

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves¹. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence¹. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.

To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)² or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)^3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation⁵ and immunoprecipitation of polysomes⁶.

FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes^3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development⁸, salt stress⁹ auxin distribution in the root¹⁰ and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem¹¹. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence^12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited⁴. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis¹⁴, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue¹⁴ and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Protocol

1. Протопластов поколения Урожай материала листьев и нарезать шириной 1 мм полосы (рис. 1) с лезвием бритвы. Для образцов, содержащих более одного листа до 15 листьев может быть легко сложены перед нарезкой. Немедленно передать листа полос, на 9 см круглой чашки Петри, содержащую 20 мл раствора (400 мМ маннит, 20 мМ MES гидрат, 20 мМ KCl, 10 мМ CaCl 2, 2 мМ MgCl 2, 0,1% BSA и 2,5 мМ β-меркаптоэтанол, рН 5,7) в том числе protoplasting ферментов (1,2% целлюлозы R-10, 0,6% целлюлозы RS и 0,4% macerozyme R-10) и РНКазы и транскрипционной ингибиторов (1 × ProtectRNA и 10 мкг / мл актиномицина D); аккуратно отделить листья полосы и вакуум проникают в течение 2 × 5 мин. Место чашку Петри на орбитальном шейкере установлена ​​на 90 мин при комнатной температуре и протопластов в течение 3-4 часов. Во время инкубации листьев полоски должны быть отделены друг от друга, путем использованияНабор плоский пинцет, через каждые полчаса. Поместите 70 мкм ячейки фильтра (Fisher Scientific) в 50 мл трубки и осторожно фильтрации раствора через protoplasting. Это позволит удалить листья полосы, которая будет храниться в сито, позволяя протопластов, чтобы пройти. Промойте листья полос с 4 мл раствора и осторожно процедить через сито же. Передача протопластов в круглых труб дно и центрифуги протопластов решение при 300 мкг в течение 5 мин для осаждения протопластов. Аккуратно аспирации от, как большая часть супернатанта насколько это возможно без нарушения протопластов. Вымойте протопластов с 5 мл раствора и центрифуги при 300 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант Ресуспендируют протопластов в соответствующий объем раствора с помощью пипетки Пастера или отсечения P1000 чаевых. 2. FACS из листьев Протопласты </p> Непосредственно перед сортировкой, ресуспендируют протопластов использовании (без разреза) P1000 совет, чтобы избежать слипания вместе протопластов. Передача протопластов к сортировке трубку, через 50 мкм фильтр filcon (BD Biosciences) и разбавить по мере необходимости, чтобы избежать засорения сопла клетки сортировщика. Протопласты сортируются с использованием 100 мкм сопла при давлении 20 фунтов (оболочка) и 21-21.5 фунтов на квадратный дюйм (образца), частота 39,2 кГц и события скорость <4000 (эти параметры являются оптимальными по мобильному сортировщик приток bd (bd biosciences). Оптимизация на других машинах сортировки клеток, возможно, потребуется корректировка этих параметров). gfp положительных протопластов определены с использованием 488 нм аргонового лазера и построения выходом из 58030 полосовой фильтр (оранжевый) сравнению 530 40 (зеленый).будет в высокой low населения, не-gfp низких низком населения мертвых > Рисунок 2. KC464, KC274 и TP382 линии, используемые в этом исследовании. A) Поперечное сечение KC464 листа показывает GFP выражение в адаксиальной эпидермиса. B) протопластов, полученных от KC464 листьев. C) Поперечное сечение KC274 листа показывает GFP выражение в сосудах. D) протопластов, полученных от KC274 листьев. E) TP382 листа показывает GFP выражение в замыкающих клеток. F) протопластов получены из TP382 листьев. G) Пример обогащения получено FACS из GFP выражение замыкающих клеток в сложном фоне листьев клетки, показывая, содержащих GFP протопластов с высокой 530/low 580 населения протопласты, полученные из TP382 листьев. AF: конфокальной микроскопии изображений; G: флуоресцентный микроскоп изображение. Шкала баров в пределах изображения 50 мкм. Рисунок 3. Типичная приобретение FACS точка участков выходом из 580/30 нм (оранжевый) по сравнению с 530/40 нм (зеленый) полосового фильтра (BD приток клетки сортировщика). Сортировка ворота указаны те, которые обычно используются во время сортировки. A) Dot участок Col-4 листа, полученные протопласты, protoplasted в отсутствие ингибиторов, показывая одну низкую 530/low 580 населения. B) Dot участке от мас Col-4 листа, полученные протопласты, protoplasted в присутствии ингибиторов, показывая сдвиг в 580 флуоресценции из-за стресса и окрашивания ингибиторов. CE) Dot участков из листьев, полученные из протопластов KC74, KC464 и TP382 линий, соответственно, protoplasted в присутствии ингибиторов, показывая GFP содержащих населения в высоком 530/low 580 населения. Проценты от событий в GFP (высокая 530/low 580) населению даны. Нажмите, чтобы увеличить показатель . e_content "FO: Keep-together.within-страница =" Всегда "> Рисунок 4. GFP выражение в закрытом представитель фракции населения, как показано на рисунке 3. Два биологических повторяет были получены для каждой фракции типа, усиливается использование Ovation Pico WTA системы и КПЦР использованием GFP-специфических праймеров (табл. 2) Затем был проведен. Значения показали самый высокий (красный), низкий (зеленый) и средние относительные значения. Высокая 580 населения в этом случае разделен на две части, низкий 530/low 580 и высокой 530/low 580, для которого одного биологического повторных была использована таким образом, только одно значение показано на рисунке. ACT2 (At3g18780) был использован в качестве стандарта для всех образцов. Лист: весь лист. Разное: Unsorted протопластов. GFP1: высокая 530/low 580 и Rest1: низкая 530/low 580, GFP2: высокая 530/high 580 и Rest2: низкая 530/high 580, как указано на рисунке 3 и вставки. Результаты проверки оF оптических оценки GFP содержимого ячейки в отсортированном фракций (например, 2G рисунок). Нажмите, чтобы увеличить показатель . Образец Количество листьев Количество клеток РНК выход (НГ) РНК выход (С усилителем; нг) Всего листа Всего B листьев 1 1 – – 8001 10525 4623 *** 4572 *** Unsorted протопласты Unsorted B протопласты 5 5 – – 2433 2625 1152 *** 3321 *** GFP1 Rest1 15 6039 (0.39% *) 55389 (6.40% *) – ** – ** 861 489 GFP1 B Rest1 B 15 10 783 (0,63% *) 57 040 (7,49% *) – ** – ** 537 420 GFP2 Rest2 15 18 337 (1,49% *) 62 405 (73,49% *) – ** – ** 360 411 Таблица 1. Пробы, взятые использованием FACS и проанализированы с КПЦР чтобы определить, какая фракция содержала живые GFP-экспрессирующих протопластов. Кроме того, в этой таблице является общим выходом РНК в нг до и после усиления с Ovation Pico WTA System (NuGen). GFP1, GFP2, Rest1 и Rest2 фракции, как показано на вставке на рисунке 4. * Процент клеток от общей операции сортировки ячейки в скобках возле числа клеток во фракции. Эти показатели не коррелируют сдруг с другом для каждого образца, как рода FACS работает для фракции "отдых" были остановлены раньше, чем для GFP фракции из-за гораздо большего числа клеток, собранных отдыха. ** 50 нг использоваться как входные данные для реакции амплификации, в соответствии с протоколом производителя. Грунтовка Последовательность mGFP5-ER.fw GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA mGFP5-ER.rv TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT ACT2.fw GCCATCCAAGCTGTTCTCTC ACT2.rv GCCATCCAAGCTGTTCTCTC Таблица 2. КПЦР праймеров.

Discussion

Мы описали метод, который позволяет использовать Arabidopsis растений, экспрессирующих GFP в листьях для генерации протопластов и последующей сортировки клеток с использованием FACS. Этот метод дает достаточного количества РНК, которые будут использоваться для усиления и поэтому последующий анализ либо КПЦР или микрочипов. Фракции отсортированы высоко обогащенные для GFP-содержащие клетки, как показали КПЦР (рис. 2).

Для достижения высоких урожаев живой протопластов важно работать быстро в течение первых шагов процедуры, пока листья полосы были вакуум проникли с ингибитором содержащих протопластов решение. Кроме того, при создании 1 полосы мм листа очень важно, чтобы нарезать или вырезать листья, а не «отбивную» или пюре из них, так как это приводит к чрезмерному повреждению и, следовательно, более низкую доходность протопластов.

Существенная разница между методом, описанным здесь и другие publisheг методов является использование ингибитора РНКазы и транскрипционной ингибиторов. Большинство методов разработаны для Arabidopsis корней, от которых протопласты могут быть получены более легко. Тем не менее, при работе с листьями, за исключением мезофилла, необходимо увеличить время протопластов поколения. Поэтому важно, чтобы включить эти ингибиторы для защиты от изменения в экспрессии генов в результате лечения протопластов поколение само по себе (данные не представлены). Тем не менее, наличие ингибиторов приводит к невозможности установить транскрипции ответа, либо путем переключения генов или выключить, которая, вероятно, чтобы сделать протопластов более уязвимы, так как это приводит к потере пластичности, с которыми по борьбе с напряжениями protoplasting процедуры.

Мы использовали метод, описанный здесь успешно число GFP-экспрессирующих Arabidopsis линий. Важно отметить, что мы использовали этот метод с GFP линий, экспрессирующих GFP либо сильно вядро, или гораздо более слабо в non-localized/diffuse цитозольного образом, как и в случае с KC464 и KC274 линии, используемые здесь. Оба типа линий совместимы с методом и получением обогащенного доли GFP-экспрессирующих протопластов (рис. 2 и 3). Этот метод может быть легко адаптирована к другим флуорофоры, хотя флуорофора должны быть выбраны для флуоресценции, что существенно отличается от аутофлюоресценции мертвых / умирающие клетки для того, чтобы сохранить возможность выбора живых клеток.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Cellulase R-10	Melford	C8001
Cellulase RS	Melford	C8003
Macerozyme R-10	Melford	M8002
BSA	Sigma-Aldrich	A3912
ProtectRNA	Sigma-Aldrich	R7397
Actinomycin D	Sigma-Aldrich	A1410
70 μm cell strainer	Fisher	FB35181
50 μm filcon cup-type filters	BD Biosciences	340630