השימוש בפיברובלסטים אנושיים ראשוניים לניטור פנוטיפים מיטוכונדריאלי בתחום מחלת פרקינסון
Summary
Fibroblasts מחולים שנשאו מוטציות בגני פרקינסון גורמי מחלות לייצג נגיש<em> Vivo לשעבר</em> מודל ללמוד פנוטיפים מחלות נלוות. הדמית תא חייה נותנת ההזדמנות ללמוד פרמטרים מורפולוגיים ופונקציונליים בתאים חיים. כאן אנו מתארים את ההכנה של fibroblasts אדם והניטור הבא של פנוטיפים המיטוכונדריה.
Abstract
המחלה (PD) פרקינסון היא הפרעת תנועה השכיחה ביותר השנייה ומשפיעה על 1% מאנשים מעל גיל 60 1. בגלל הזדקנות היא גרם הסיכון החשוב ביותר, במקרים של פרקינסון יגדילו בעשרות השנים הבאות 2. בא לקיפול החלבונים פתולוגי ומסלולי פירוק חלבונים פגומים, שינויי התפקוד והמורפולוגיה המיטוכונדריה היו מצביעים כסימן היכר נוסף של ניוון מוחיה בפ"ד 3-11.
לאחר שנים של מחקר בתאי סרטן עכבריים ואנושיים כמו גם במודלים חוץ גופייה לנתח מסלולים מולקולריים של מחלת הפרקינסון, השימוש בfibroblasts אדם מחולים ובקרות מתאימות כמודלי vivo לשעבר הפך לכלי מחקר יקר, אם אזהרות פוטנציאליות יובאו בחשבון. מלבד הנציחו דגמים, תאים מלאכותיים למדי, fibroblasts העיקרי מחולים שנשאו מוטציות מחלה הקשורים ככל הנראה משקף תכונות פתולוגיים חשובות of המחלות האנושיות.
כאן אנו משרטטים את ההליך של לקיחת ביופסיות עור, פיברובלסטים culturing אדם ושימוש בפרוטוקולים מפורטים לטכניקות מיקרוסקופיות חיוניות להגדרת פנוטיפים המיטוכונדריה. אלה שמשו כדי לחקור תכונות שונות הקשורות לפ"ד שרלוונטיים לתפקוד ודינמיקה של המיטוכונדריה. Vivo לשעבר, המיטוכונדריה יכולה להיות מנותחת במונחים של תפקידם, המורפולוגיה, colocalization עם lysosomes (האברונים משפילים המיטוכונדריה מתפקדת) והשפלה דרך מסלול lysosomal . פנוטיפים אלה הם רלוונטיים ביותר לזיהוי הסימנים המוקדמים של מחלת הפרקינסון ועלולים להקדים את הסימפטומים מוטוריים קליניים בנישאי מחלה גנטית אנושיים. לפיכך, מבחנים שהוצגו כאן יכולים להיות מנוצלים ככלים חשובים לזהות מאפיינים פתולוגיים של ניוון מוחיה, ולעזור להגדיר אסטרטגיות טיפוליות חדשות בפרקינסון.
Protocol
Discussion
fibroblasts עור מטופל כמודלי vivo לשעבר מייצג כלי חשוב לאפיין פגמים גנטיים למחלה נלווית. בנוסף, fibroblasts עור הנגזר נגיש בקלות וניתן להרחיב על culturing. לכן, תאים ראשוניים המתקבלים מחולים שנשאו מוטציות גנטיות הקשורים פ"ד עדיפים על השימוש בשורות תאים סרטניות כפי שהם מכילים ל…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן תיסן (10.11.2.153 לר.ק.), המועצה למחקר הגרמניה (DFG, KR2119/3-2 וKR2119/8-1 לר.ק.), המשרד הפדרלי לחינוך ולמחקר (BMBF , NGFNplus; 01GS08134 לר.ק.) ועל ידי מלגת דוקטורט מHertie קרן הצדקה [לLFB]. אנו מודים קרולין Obermaier וג'וליה סטרמאייר על תמיכתם בזמן צילומי וידאו.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue no. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Invitrogen | 52400-025 |
| RPMI 1640 medium, no Phenol Red | Invitrogen | 11835-063 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Invitrogen | 14190-094 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 100-18B |
| AccuMax (detachment solution) | PAA | L11-008 |
| Lab-TekTMII chambered coverglasses | Nalge Nunc International | 115382 |
| Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) | Invitrogen | T-669 |
| Mitotracker Green FM | Invitrogen | M-7514 |
| Mitotracker CM-H2XRos | Invitrogen | M-7513 |
| Lyostracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
References
- de Rijk, M. C., Launer, L. J., Berger, K., Breteler, M. M., Dartigues, J. F., Baldereschi, M., Fratiglioni, L., Lobo, A., Martinez-Lage, J., Trenkwalder, C. Prevalence of Parkinson’s disease in Europe: A collaborative study of population-based cohorts. Neurologic Diseases in the Elderly Research Group. Neurology. 54, 21-23 (2000).
- Dorsey, E. R., Constantinescu, R., Thompson, J. P., Biglan, K. M., Holloway, R. G., Kieburtz, K., Marshall, F. J., Ravina, B. M., Schifitto, G., Siderowf, A. Projected number of people with Parkinson disease in the most populous nations. Neurology. 68, 384-386 (2005).
- Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. Alpha-synuclein in Lewy bodies. Nature. 388, 839-840 (1997).
- Chung, K. K., Zhang, Y., Lim, K. L., Tanaka, Y., Huang, H., Gao, J., Ross, C. A., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Parkin ubiquitinates the alpha-synuclein-interacting protein, synphilin-1: implications for Lewy-body formation in Parkinson disease. Nature. 7, 1144-1150 (2001).
- Kruger, R., Eberhardt, O., Riess, O., Schulz, J. B. Parkinson’s disease: one biochemical pathway to fit all genes. Trends Mol. Med. 8, 236-240 (2002).
- Krebiehl, G., Ruckerbauer, S., Burbulla, L. F., Kieper, N., Maurer, B., Waak, J., Wolburg, H., Gizatullina, Z., Gellerich, F. N., Woitalla, D. Reduced basal autophagy and impaired mitochondrial dynamics due to loss of Parkinson’s disease-associated protein DJ-1. PLoS One. 5, e9367 (2010).
- Exner, N., Treske, B., Paquet, D., Holmstrom, K., Schiesling, C., Gispert, S., Carballo-Carbajal, I., Berg, D., Hoepken, H. H., Gasser, T. Loss-of-function of human PINK1 results in mitochondrial pathology and can be rescued by parkin. J. Neurosci. 27, 12413-12418 (2007).
- Burbulla, L. F., Krebiehl, G., Kruger, R. Balance is the challenge–the impact of mitochondrial dynamics in Parkinson’s disease. European journal of clinical investigation. 40, 1048-1060 (2010).
- Strauss, K. M., Martins, L. M., Plun-Favreau, H., Marx, F. P., Kautzmann, S., Berg, D., Gasser, T., Wszolek, Z., Muller, T., Bornemann, A. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson’s disease. Human molecular genetics. 14, 2099-2111 (2005).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of cell biology. 183, 795-803 (2008).
- Dagda, R. K., Cherra, S. J., Kulich, S. M., Tandon, A., Park, D., Chu, C. T. Loss of PINK1 function promotes mitophagy through effects on oxidative stress and mitochondrial fission. The Journal of biological chemistry. , 284-13843 (2009).
- Kieper, N., Holmstrom, K. M., Ciceri, D., Fiesel, F. C., Wolburg, H., Ziviani, E., Whitworth, A. J., Martins, L. M., Kahle, P. J., Kruger, R. Modulation of mitochondrial function and morphology by interaction of Omi/HtrA2 with the mitochondrial fusion factor OPA1. Experimental cell research. 316, 1213-1224 (2010).
- Burbulla, L. F., Schelling, C., Kato, H., Rapaport, D., Woitalla, D., Schiesling, C., Schulte, C., Sharma, M., Illig, T., Bauer, P. Dissecting the role of the mitochondrial chaperone mortalin in Parkinson’s disease: functional impact of disease-related variants on mitochondrial homeostasis. Human molecular genetics. 19, 4437-4452 (2010).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Nguyen, H. N., Byers, B., Cord, B., Shcheglovitov, A., Byrne, J., Gujar, P., Kee, K., Schule, B., Dolmetsch, R. E., Langston, W. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
- Seibler, P., Graziotto, J., Jeong, H., Simunovic, F., Klein, C., Krainc, D. Mitochondrial Parkin recruitment is impaired in neurons derived from mutant PINK1 induced pluripotent stem cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 5970-5976 (2011).
