Summary
ביוסינתזה של מטריקס סחוסים ידי כונדרוציטים יכולה להיות מושפעת על ידי יישום של גירויים מכאניים. שיטה זו מתארת את הטכניקה של החלת זני דחיסה דינמיים לכונדרוציטים גלומים במבני 3D וההערכה של Induced שינויים בחילוף חומרי chondrocyte.
Abstract
סחוס במפרק סובל מיכולת תיקון מוגבלת, כאשר נפגע על ידי עלבון מכאני או מושפל על ידי מחלה, כגון דלקת מפרקים ניוונית. כדי לתקן את הליקוי הזה, כמה התערבויות רפואיות פותחו. שיטה אחת כזו היא לשוב אל פני שטח לאזור הפגוע ברקמת סחוס מהונדס, אך בדרך כלל רקמה המהונדסת חסרות את המאפיינים ועמידות ביוכימיים של סחוס מקורי, חקירת השרידות ארוכות הטווח שלו. זה מגביל את יישום הנדסת רקמות סחוס לתיקון פגמי מוקד קטנים, בהסתמך על הרקמה שמסביב כדי להגן על החומר המושתל. כדי לשפר את התכונות של הרקמות המפותחות, גירוי מכאני הוא שיטה פופולרית משמשת להגברת הסינתזה של מטריקס סחוסים, כמו גם את התכונות המכאניות כתוצאה של הרקמות המהונדסות. גירוי מכאני חל כוחות לרקמה בונה מקביל לאלו בגוף חי. זההוא מבוסס על ההנחה שהסביבה המכאנית, בחלקו, מסדירה את הפיתוח והתחזוקה של 1,2 רקמת ילידים. הצורה הנפוצה ביותר מיושמת של גירוי מכאני בהנדסת רקמת סחוס היא דחיסה דינמית בזנים פיסיולוגיים של כ 5-20% בתדירות של 1 הרץ 1,3. מספר מחקרים בחנו את ההשפעה של דחיסה דינמית והראו את זה יש השפעה חיובית על חילוף חומרים וביוסינטזה chondrocyte, סופו של דבר משפיע על התכונות הפונקציונליות של 4-8 רקמות המפותחות. במאמר זה, אנו מדגימים את השיטה המכאנית כדי לעורר מבנים הידרוג chondrocyte-agarose תחת דחיסה דינמית ולנתח שינויים ביוסינתזה דרך מבחנים ביוכימיים וradioisotope. שיטה זו יכולה גם להיות שונה כדי קושי להעריך את שינויים שנגרמו פוטנציאל בתגובה תאית כתוצאה מגירויים מכאניים.
Protocol
1. בידוד של כונדרוציטים במפרק ראשי
קציר 10-15 פרוסות סחוס בעובי מלאה ממשטחי המפרקים של מפרקים בבעלי חיים (למשל משותף מסרק-phalangeal של פרות בשלות כשלד המתקבלות מabbatoir מקומי).
- פרוסות סחוס מניח בתבנית 100 מ"מ פטר ודגירה ב20 מ"ל של פרוטאז 0.5% בשינקין של F-12 (w / v) עבור 2 שעות ב 37 ° C. יש לשטוף שלוש פעמים בF-12 תקשורת התרבות של שינקין, ודגירה עם 20 מ"ל של collagenase 0.15% בF-12 התקשורת של שינקין תרבות הלילה ב 37 ° C.
- סנן השעית התא דרך מסנן מסך רשת 200 לתוך צלחת נקיה. שטוף את המסנן עם 5 מ"ל של Ham של F-12 ולהוסיף לתבשיל. להעביר את השעית התא לצינור 50 מיליליטר חרוטים. לשטוף את צלחת פטרי עם 10 מ"ל של Ham של F-12 ולהוסיף לצינור החרוטים.
- צנטריפוגה הצינור ב600-800 RCF במשך 6-8 דקות בטמפרטורת חדר.
- לשאוב supernatant, ומבטיח לא להפריע הדואר תא גלולה ומחדש להשעות ב40 מ"ל של F-12 תקשורת התרבות של שינקין.
- צנטריפוגה הצינור ב600-800 RCF במשך 6-8 דקות.
- חזור על שלבים 1.4 ו 1.5 פעמים יותר עבור סכום כולל של 3 פעמים. לפני צנטריפוגה בפעם השלישית, resuspend הגלולה באמצעות התססה ולקבל aliquot μl 500 לספירת תאים.
- ספירת תאי קיימא בשיטת ההדרה הכחולה Trypan 9 עם hemacytometer ומיקרוסקופ אור הפוכה.
- לשאוב supernatant מחדש להשעות את הגלולה בהיקף של התקשורת של שינקין F-12 להכפיל את צפיפות הזריעה הרצויה (למשל 20 x 10 6 תאים / מ"ל לריכוז סופי של 10 x 10 6 תאים / מ"ל אחרי אנקפסולציה).
2. Encapsulation Hydrogel Chondrocyte-agarose
- חום 0.8 גרם autoclaved סוג השביעי agarose ב20 מ"ל של 1x PBS סטרילי (pH 7.4) על צלחת חמה להגדיר עד 120 מעלות צלזיוס עד שהיא נמסה. ברגע מומס, מנמיך את האש עד 60 ° C כמו טמפרטורות גבוהות will להשפיע כדאיויות תא.
- בצינור 50 מיליליטר חרוטים, יסודיות לערבב כמויות שווות של השעית התא עם הריכוז הכפול הרצוי של agarose (למשל 4% להשעית agarose 2% הידרוג agarose סופי). הימנע מיצירת הבועות גדולות כפי שהם יכולים להשפיע על כדאיויות תא ולבנות חיים עייפים.
- זהירות 10 מיליליטר aliquot של תערובת chondrocyte-agarose לתוך צלחת פטרי קוטר 60 מ"מ, תוך הימנעות מיצירת בועות גדולות.
- בואו לעמוד במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר עד gelled.
- השג כמה שיותר דגימות הידרוג chondrocyte-agarose לפי הצורך (בדרך כלל 20-30) באמצעות 4 מ"מ ביופסית אגרוף.
- למדוד ולתעד את הממדים הפיסיים (קוטר וגובה) של מדגמים מייצגים באמצעות מיקרומטר. מבנים צריכים להיות כ 5 מ"מ הגובה, לבטל את כל דגימות שהתקבלו מאזור שבו דגימת שונות הגובה הייתה גדול מ 2%.
- העברת דגימות לצלחת פטרי 60 מ"מ טריה ותוספתעם 10 מ"ל של מדיה מלאה (20% בסרום למשל עוברים מבקר בF-12 תקשורת התרבות של שינקין עם 20 HEPES מ"מ, 100 מיקרוגרם חומצה / מ"ל אסקורבית ואנטיביוטיקה / antimycotics 2x).
3. גירוי וRadiolabelling מכאני של הידרוג Chondrocyte-agarose
- חיטוי הרכיבים המתכתיים של מתקן הדחיסה. לעקר את רכיבי פלסטיק עם אתנול 70% (לילה) ואור UV (לפחות 15 דקות).
- כדי לשמור על מבנים את הנפילה, באמצעות מלקחיים, מקום 12 טבעות פלסטיק סטריליים התמך (עם קוטר פנימי גדול יותר מקוטר התבנית) (n = 6, דגימות ובקרה) בתוך הבארות של צלחת תרבות 24 גם.
- באמצעות מלקחיים, להעביר בזהירות את הידרוג chondrocyte-agarose מצלחת פטרי לצלחת 24 היטב, הבטחה שכל אחד במטבע חיזוק.
- העברת 400 μl של מדיה מלאה (לדוגמא 20% FBS בF-12 תקשורת התרבות של שינקין עם 20 HEPES מ"מ, 100 מיקרוגרם / מיליליטר חומצה אסקורבית, ו2x אנטיביוטיקה / antimycotics) לכל דגימה היטב.
- להרכיב את מתקן הדחיסה המעוקרת (איור 1) ולהבטיח את platens עם ברגים שנקבעו. צרף מתקן הדחיסה לצלחת התרבות 24 גם.
- שחרר ולהבטיח מחדש את הברגים הקבועים ליצור קשר Platen-הידרוג'ל (אפס מדינת מתח).
- טען את מתקן הדחיסה התאסף לתוך מערכת בדיקת micromechanical מאך-1. מתקן מאובטח על הבמה האנכית באמצעות סיכה ונעילת איתור המקום עם בורג סט. הסר את מחול המרווח.
- החל טעינת דחיסה דינמית במשרעת רצויה (למשל 10% משרעת מתח המבוססת על הגובה המקורי של דגימות), תדירות (1 לדוגמא רץ) ומשך או מספר המחזורים (למשל מרווחי זמן של עד 60 דקות).
- עם השלמת הגירוי מכאני, החלף את מחול המרווח, שחרר את בורג סט סיכת האיתור ולהסיר את מעטת הדחיסה וצלחת תרבות מבדיקת מערכת micromechanical מאך-1. מבני Radiolabel תא הידרוג ידי להשלים את התקשורת עם 5 μCi של איזוטופ הרצוי (למשל [3 ח] תווית חלבון פרולין לסינתזת הקולגן chondrocyte ספציפית ו[ 35 S] גופרית לסינתזת גליקן).
- דגירת מבני radiolabeled עבור 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 10.
- לקצור את המבנים הידרוג radiolabeled ולשטוף 3 פעמים ב1x PBS (pH 7.4), כדי להסיר כל איזוטופ מאוגד. דגימות Digest באמצעות פפאין (40 מיקרוגרם / מ"ל ביצטט אמוניום 20 מ"מ, חומצת 1 מ"מ ethyldiaminetetraacetic וdithiothreitol 2 מ"מ על 65 המעלות צלזיוס במשך 72 שעות).
- Assay לעכל לתוכן דנ"א באמצעות assay PicoGreen הצבע 11 ופעילות איזוטופ משולב, מנורמל לתוכן ה-DNA, על ידי נצנץ β-נוזל ספירת עיכול פפאין מייד לאחר 12,13.
הערה: הרכישה וסילוק חומרים רדיואקטיביים (איזוטופים פסולת ופריטיםשייתכן שהגיע לחומרים רדיואקטיביים מגע) חייב לעקוב מדיניות (ו / או ממשלתי) ונהלים לטיפול וסילוק הבטוח של חומרים רדיואקטיביים מוסדי רלוונטי.
4. נציג תוצאות
מבני שור מפרקי chondrocyte-agarose הידרוג (2% agarose עם 10 10 x 6 תאים / תאים כמוסים מ"ל) היו מגורה מכאני בהמשרעת של מתח דחיסה 10% בתדירות של הרץ 1 במשך 20 עד 60 דקות (או 1200 ל3600 מחזורים ) וassayed לתוכן ה-DNA וסינתזה תאית על ידי שילוב radioisotope. ה-DNA וסינתזת מטריקס הושפעה באופן תלוי מינון. תוכן ה-DNA הראה ירידה משמעותית 35% כתוצאה מ20 או 30 דקות של גירוי (p <0.01), ואילו 60 דקות של גירוי הציגו שום אפקט (איור 2). סחוס ספציפי סינתזת הקולגן וגליקן (נקבע על ידי [3 ח]-פרולין ו [35 S] שילוב גופרית, בהתאמה) הציג עלייה משמעותית של כ 60% בתגובה ל20 או 30 דקות של גירוי (p <0.01), עם 60 דקות של גירוי אינה מראה סימני השפעה משמעותית (איור 3).
. האיור 1 סכמטי של מתקן הדחיסה הדינמית שהותקן על גירוי מבני chondrocyte-agarose שמאל:. אסדה מורכבת ימני:. התפוצץ נוף מראה רכיבים בודדים.
איור 2. שינויים בתוכן ה-DNA של chondrocyte-agarose הידרוג מגורה מכאני תחת משרעת 10% דחיסת מתח ברץ 1 במשך 20 עד 60 דקות (ממוצע ± SEM, n = 6/group).
her.within עמודים = "תמיד"> 
איור 3. שינויים בסינתזה תאית (קולגן וproteoglycans) של agarose chondrocyte הידרוג מגורה מכאני תחת משרעת מתח דחיסה 10% בהרץ 1 במשך 20 עד 60 דקות (ממוצע ± SEM, n = 6/group).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת ליישום גירויים מכאניים מבוקרים לתא בעלת גרעין agarose הידרוג מאפשרת חקירה הישירה להשפעות של כוחות דחיסה דינמיים בחילוף חומרי chondrocyte. השימוש במתקן לבדיקה מותאמת אישית בשילוב עם טבעות התמך ספק מגבלת רוחב למבנים כדי להימנע מבעיות פוטנציאליות של מדגם מפנה. השימוש בplatens טעינה המת המשוקלל מובטחים בצוותות ערכות מבטיח מגע ישיר עם מבנים למרות הבדלים פוטנציאליים בגובה מדגם. Radiolabeling לאחר הגירוי למדוד ביוסינתזה סלולרית מפחיתה את הפוטנציאל לזיהום, ומאפשר למתקן בדיקה אחת כדי להיות מנוצל ליישומים מרובים של גירויים מכאניים דינמיים. שיטה זו ניתן להתאים בקלות כדי לחקור את ההשפעה של מצבי טעינה מכאניות שונים (לדוגמה: 1,4 גזירה, מתח 1,2) או להבהיר mechanotransduction הספציפי מסלולים אחראי.
ove_content "> התוצאות המייצגות מאוירות שכמות קטנה של מות תאים של כ 35% יכולה להתרחש עקב היישום של גירוי דינמי, עם יישומים ארוכים יותר של גירוי מכאני לא משפיע על מבנה תאי 15-17. יוסינתזה של מקרומולקולות התאית מטריקס, שנקבעו על ידי התאגדות radioisotope, מאוירת תגובה תלויה משך לדחיסה דינמית. יישומים של טעינת דחיסה דינמית לתקופה של 20 עד 30 דקות ביאה לתגובה אנבולית מקסימלי עם משכי זמן המופיעים לעורר השפעת הפחתת רגישות לגירויים המכאניים הכפויים. הקהיה ניידת למכאנית טעינה כבר ציין בעבר 1,2,5,13, אבל יש כבר חקירה קטנה לתוך האפיון של הטבע התלוי הזמן של תופעה זו. מידע זה יכול לשמש כדי לקבוע את התנאים האופטימליים על מנת למקסם את גירוי ההצטברות של מטריקס עם לבנות under חוזר ונשנה, או לטווח ארוך, יישומים של גירוי מכאני.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Protease | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Ascorbate | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antibiotics/antimycotics | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papain from papaya latex | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Ethyldiaminetetraacetic Acid | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Low Melting Point Agarose, Type VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Mesh Screen (200) Filter | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mach-1 Micromechanical Tester | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Compression Loading Jig | Custom-built | Similar product could be supplied by Biomomentum Inc. | |
| Falcon 24 Well Culture Plate | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Liquid Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Proline | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Sulfur | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
References
- Grodzinsky, A. J. Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).
- Kuettner, K. E. Biochemistry of articular cartilage in health and disease. Clinical Biochemistry. 25, 155-163 (1992).
- Neu, C. P. The interface of functional biotribology and regenerative medicine in synovial joints. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 235-247 (2008).
- Demarteau, O. Dynamic compression of cartilage constructs engineered from expanded human articular chondrocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 310, 580-588 (2003).
- Waldman, S. D. Long-term intermittent compressive stimulation improves the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 10, 1323-1331 (2004).
- Hunter, C. J. Dynamic compression of chondrocyte-seeded fibrin gels: effects on matrix accumulation and mechanical stiffness. Osteoarthritis and Cartilage. 12, 117-130 (2004).
- Buschmann, M. D. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. Journal of Cell Science. 108 (Pt 4), 1497-1508 (1995).
- Quinn, T. M. Mechanical compression alters proteoglycan deposition and matrix deformation around individual cells in cartilage explants. Journal of Cell Science. 111 (Pt 5), 573-583 (1998).
- Kuettner, K. E. Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. I. Isolation, culture characteristics, and morphology. The Journal of Cell Biology. 93, 743-750 (1982).
- Lee, D. A. Mechanical loading of chondrocytes embedded in 3D constructs: in vitro methods for assessment of morphological and metabolic response to compressive strain. Methods in Molecular Medicine. 100, 307-324 (2004).
- McGowan, K. B. Biochemical quantification of DNA in human articular and septal cartilage using PicoGreen and Hoechst 33258. Osteoarthritis and Cartilage. 10, 580-587 (2002).
- Fan, J. C. Y. The effect of intermittent static biaxial tensile strains on tissue engineered cartilage. Annals of Biomedical Engineering. 38, 1672-1682 (2010).
- Kaupp, J. A. Mechanical vibrations increase the proliferation of articular chondrocytes in high-density culture. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 222, 695-703 (2008).
- Waldman, S. D. Long-term intermittent shear deformation improves the quality of cartilaginous tissue formed in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 21, 590-596 (2003).
- Waldman, S. D. A single application of cyclic loading can accelerate matrix deposition and enhance the properties of tissue-engineered cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 14, 323-330 (2006).
- Kisiday, J. D. Effects of dynamic compressive loading on chondrocyte biosynthesis in self-assembling peptide scaffolds. Journal of Biomechanics. 37, 595-604 (2004).
- Chowdhury, T. T. Temporal regulation of chondrocyte metabolism in agarose constructs subjected to dynamic compression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 417, 105-111 (2003).
