Fonksiyonel Tahliller için Doku Antijenleri çıkarımı
Summary
Fonksiyonel T-hücre deneylerinde antijen kaynağı olarak kullanılacak insan doku özleri hazırlamak için basit bir protokol tarif edilmektedir. Bu yöntem, doku-türetilmiş antijenleri ile T-hücresi yanıtı ölçülmesine imkan verir<em> In vitro</em>.
Abstract
B ve T hücreleri tarafından tanınan adaptif immün yanıtı antijen hedefleri, çoğu 1 tanımlanmamıştır. Bu otoimmün hastalıklar ve kanser 2 özellikle doğrudur. Amacımız, otoimmün hastalığı tip 1 diyabet 1,3,4,5 olarak insan T-hücreleri tarafından tanınan antijenler araştırmaktır. T hücreleri tarafından tanınan antijen tespit edilmemiş doku karşı insan T-hücre yanıtlarını analiz etmek için fonksiyonel testler 6 ile uyumlu bir biçimde insan dokusunda protein antijenleri ayıklamak için bir yöntem geliştirdi. Ekstraksiyon yöntemleri, insan periferik kan mononükleer hücreleri için toksik olan deterjanlar içerdiği bir lizat verim nedeniyle arıtılmadan doku özleri önce, T-hücre yanıtlarını ölçülür edilemedi. Burada insan T hücreleri için toksik olmayan bir biçimde insan dokularından protein ayıklamak için bir protokol açıklar. Doku butan-1-ol, asetonitril ve wat bir karışımı içinde homojenize edilirer (BAW). Doku ekstraktı olarak protein konsantrasyonu ölçülür ve protein, bilinen bir kütle tüpler içine bölünüp edilir. Ekstraksiyon uygulandıktan sonra, organik çözücüler liyofilizasyon ile çıkarılır. Kullanılıncaya kadar liyofilize doku ekstreleri saklanabilir. Bağışıklık fonksiyonu, bağışıklık hücrelerinin bir süspansiyonu tahlillerde kullanım için, uygun bir kültür ortamı içinde, liyofilize özü doğrudan ilave edilebilir. Bu yöntemi kullanarak hazırlanan ekstreler cevaben PBMC tarafından sitokin üretimi ve proliferasyonu, kolayca ölçülmüştür. Dolayısıyla, yöntem, T-hücresi yanıtlarının analizi antijen kaynağı olarak kullanılabilecek insan doku lizatları hızlı hazırlanmasını sağlar. Bu yöntem nakli, kanser ve otoimmünitede dokulara adaptif immün yanıtların analizi kolaylaştıracaktır öneririz.
Protocol
Discussion
Biz deterjan gibi toksik kimyasallar ücretsiz insan dokusunda bir özü oluşturmak istedim, çünkü bu protokol geliştirilmiştir. Özellikle in vitro insan bağışıklık işlevi metodlarda kullanılan insan doku özleri hazırlamak için kullanılmıştır. Bu protokol kullanılarak hazırlandı özler eşit herhangi bir tampon içinde yeniden oluşturulmuş ve bu gibi western blot ya da sıvı kromatografi gibi pek çok biyokimyasal analizler için de kullanılabilir. Bu birçok downstream uygulamalar i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC # 559007) ve Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı (JDRF 4-2006-1025) ve Victoria Hükümeti Operasyonel Altyapı Programı hibeleri ile desteklenmektedir. Biz insan dokuları sağlamak için Tom Mandel Islet Nakli Programı Islet İzolasyon Takımı üyelerine teşekkür ediyorum. İnsan dokularında yerel etik kurul onayı ile toplandı ve kullanıldı (St Vincent Hastanesi HREC-A 011/04 ve St Vincent Sağlık HREC-A 135/08).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes | BD Falcon | 352054 | |
| Caps for tubes polystyrene tubes (above) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml sterile tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrile | Mallinckradt Chemicals | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogenizer: PRO200 | Bio-strategy | 01-01200 | 10 x 115 mm saw-tooth generator |
| Lyophilizer | Virtis, Benchtop 4K | ||
| Sterile Needle 18-20 gauge | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
References
- Mannering, S. I. Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).
- Beckhove, P. Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation. J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).
- Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes. Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).
- Mannering, S. I. The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).
- Mannering, S. I. The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified. J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).
- Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays. Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).
- Mannering, S. I. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).
- Mannering, S. I. CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).
- Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide. Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).
- Peakman, M. Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes. Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).
- Honey, K., Rudensky, A. Y. Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation. Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).
