פרוטוקול פשוט להכנת תמציות של רקמה אנושית שתשמש כמקור לאנטיגנים במבחנים תפקודיים תא T מתואר. שיטה זו מאפשרת תגובות תא T לאנטיגנים המופקים מרקמות כדי להימדד<em> במבחנה</em>.
רבים מיעדי אנטיגן של תגובה חיסונית אדפטיבית, המוכרים על ידי תאי T, B ולא הוגדרו 1. זה נכון במיוחד במחל אוטואימוניות וסרטן 2. המטרה שלנו היא לחקור את האנטיגנים מוכרים על ידי תאי T אנושיים בסוג המחלה אוטואימונית 1 הסוכרת 1,3,4,5. כדי לנתח את התגובות אנושיות תא T נגד רקמות שבו אנטיגנים המוכרים על ידי תאי T אינם מזוהים פתחנו שיטה לחילוץ אנטיגנים חלבון מרקמה אנושית בתבנית תואמת עם מבחנים תפקודיים 6. תגובות בעבר, תאים-T לתמציות רקמות unpurified לא ניתן היו למדוד, משום ששיטות החילוץ להניב lysate שהכיל חומרי ניקוי שהיו רעילים לתאי דם היקפי אדם mononuclear. כאן אנו מתארים פרוטוקול לחילוץ חלבונים מרקמות אדם בתבנית שאינה רעיל לתאי T אנושיים. רקמת homogenized בתערובת של, אצטוניטריל butan-1-ol וואטאה (Baw). ריכוז החלבון בתמצית הרקמה נמדד ומסה ידועה של חלבון aliquoted לתוך צינורות. לאחר חילוץ, הממסים האורגניים יוסרו על ידי lyophilization. תמציות רקמות Lyophilized ניתן לאחסן עד נדרשים. לשימוש במבחנים של תפקוד מערכת חיסוני, השעיה של תאי חיסון, בתקשורת התרבות המתאימה, ניתן להוסיף ישירות לתמצית lyophilized. ייצור ציטוקינים ושגשוג על ידי PBMC, בתגובה לתמציות שהוכנו באמצעות שיטה זו, נמדדו בקלות. לפיכך, השיטה שלנו מאפשרת הכנה המהירה של lysates רקמות האנושיים שיכול לשמש כמקור לאנטיגנים בניתוח של תגובות תא T. אנו ממליצים כי שיטה זו תאפשר הניתוח של תגובות חיסוניות מסתגלות לרקמות בהשתלה, סרטן והתפתחות מחלה.
פרוטוקול זה פותח בגלל שרצינו להפיק תמצית מרקמה האנושית שהייתה חופשי מכימיקלים רעילים כגון חומרי ניקוי. באופן ספציפי יש לנו השתמשנו בו כדי להכין תמצית של רקמה האנושית שניתן להשתמש במבחנים של תפקוד מערכת חיסון של אדם במבחנה. תמציות שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה באו?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מהבריאות האוסטרלית הלאומיות והמועצה למחקר רפואי (NHMRC # 559007) וסוכרת נעורי Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) ותכנית התשתיות התפעולית של הממשלה ויקטוריאני. אנו מודים לחברי צוות טום מנדל איילט להשתלות תכנית איילט הבידוד למתן רקמות האדם. רקמות אדם נאספו ושימוש באישור אתי מקומי (בית חולי סנט וינסנט HREC-הבריאות של סנט וינסנט 011/04 וHREC-135/08).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes | BD Falcon | 352054 | |
Caps for tubes polystyrene tubes (above) | BD Falcon | 352032 | |
50ml sterile tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
Acetonitrile | Mallinckradt Chemicals | 2856-10 | |
Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
Homogenizer: PRO200 | Bio-strategy | 01-01200 | 10 x 115 mm saw-tooth generator |
Lyophilizer | Virtis, Benchtop 4K | ||
Sterile Needle 18-20 gauge | Becton Dickinson | REF 302032 | |
CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
PBS | Sigma | D8537 |
Table 1. Specific reagents and equipment.