Extraktion av Tissue Antigens för Funktionella analyser
Summary
Ett enkelt protokoll för framställning extrakt av mänsklig vävnad som skall användas som en källa för antigener i funktionella T-cell-analyser beskrives. Denna metod tillåter T-cellsvar mot vävnads-härledda antigener som skall mätas<em> In vitro</em>.
Abstract
Många av antigen mål adaptiva immunsvaret, som erkänns av B-och T-celler, har inte definierats 1. Detta är särskilt sant i autoimmuna sjukdomar och cancer 2. Vårt mål är att undersöka de antigener känns igen av humana T-celler i den autoimmuna sjukdomen typ 1-diabetes 1,3,4,5. För att analysera humana T-cellsvar mot vävnaden där de antigener som känns igen av T-celler inte är identifierade vi utvecklat en metod för att extrahera proteinantigener från mänsklig vävnad i ett format som är kompatibelt med funktionella analyser 6. Tidigare, T-cell-svar på orenade vävnadsextrakt kunde inte mätas eftersom extraktionsmetoder ger ett lysat som innehöll detergenter som var toxiska för humana perifera blodmononukleära celler. Här beskriver vi ett protokoll för att extrahera proteiner från mänskliga vävnader i ett format som inte är giftigt för humana T-celler. Vävnaden homogeniseras i en blandning av butan-1-ol, acetonitril och WatER (BAW). Proteinkoncentrationen i vävnaden extraktet mäts och en känd massa av protein alikvoterades i tuber. Efter extraktion, de organiska lösningsmedlen avlägsnades genom lyofilisering. Lyofiliserade vävnadsextrakt kan lagras tills den behövs. För användning i analyser av immunfunktion, en suspension av immunceller, i lämpliga odlingsmedier, kan tillsättas direkt till den lyofiliserade extraktet. Cytokinproduktion och proliferation genom PBMC som svar på extrakt framställda med denna metod, var lätt mätas. Följaktligen, tillåter vår metod snabb framställning av mänsklig vävnad lysat som kan användas som en källa för antigener i analysen av T-cellsvar. Vi föreslår att denna metod kommer att underlätta analysen av adaptiva immunsvar till vävnader vid transplantation, cancer och autoimmunitet.
Protocol
Discussion
Detta protokoll har utvecklats för att vi ville skapa ett utdrag ur mänsklig vävnad som var fri från giftiga kemikalier, såsom rengöringsmedel. Specifikt har vi använt den för att bereda extrakt av mänsklig vävnad som kan användas i analyser av mänsklig immunförsvar in vitro. Extrakt framställda med användning av detta protokoll kan likaledes rekonstitueras i en buffert och användas för många biokemiska analyser, såsom Western blotting eller vätskekromatografi. Detta gör denna teknik tillä…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av bidrag från Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC # 559.007) och Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) och det operativa infrastruktur systematiken i viktorianska regeringen. Vi tackar medlemmarna i Tom Mandel Islet Transplantation Program Islet Isolation Team för att tillhandahålla de mänskliga vävnader. Mänskliga vävnader samlas in och används med lokala etiska godkännanden (Saint Vincent Sjukhus HREC-A 011/04 och St Vincent Health HREC-A 135/08).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes | BD Falcon | 352054 | |
| Caps for tubes polystyrene tubes (above) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml sterile tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrile | Mallinckradt Chemicals | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogenizer: PRO200 | Bio-strategy | 01-01200 | 10 x 115 mm saw-tooth generator |
| Lyophilizer | Virtis, Benchtop 4K | ||
| Sterile Needle 18-20 gauge | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
References
- Mannering, S. I. Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).
- Beckhove, P. Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation. J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).
- Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes. Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).
- Mannering, S. I. The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).
- Mannering, S. I. The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified. J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).
- Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays. Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).
- Mannering, S. I. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).
- Mannering, S. I. CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).
- Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide. Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).
- Peakman, M. Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes. Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).
- Honey, K., Rudensky, A. Y. Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation. Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).
