ניקוז ידני של חדרי המוח העוברי דג הזברה
Summary
אנו מציגים שיטה לאיסוף נוזל שדרה (CSF) וליצור מערכת שאין בה CSF בתוך מערכת חדרית מוח דג הזברה העוברית. זה מאפשר לבדיקה נוספת של רכב CSF והדרישה שלה במהלך התפתחות מוח העוברית.
Abstract
נוזל השדרתי (CSF) הוא נוזל עשיר חלבון מכיל בתוך החדרים במוח. היא נמצאת במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת חוליות ונמשכת לאורך כל חיים. מבוגרי CSF הוא חשב לרפד את המוח, להסיר פסולת, ולשאת 1,2 מולקולות מופרשות. במבוגרים ומבוגרים העובר, רוב CSF נעשה על ידי דמה עין המקלעת, סדרה של אזורי הפרשת כלי דם מאוד ממוקמים סמוך למוח החללים 3-5. בדג הזברה, דמה עין המקלעת נוצרה במלואו בשעות שלאחר ההפריה 144 (hpf) 6. לפני זה, בעוברי החולייתנים הוא דג זברה ואחרים, כוללים עכבר, כמות משמעותית של עוברי CSF (eCSF) הוא הווה. נתונים אלה ומחקרים מראים כי בחומוס neuroepithelium היא הפרשה מוקדם בפיתוח ועלולה להיות המקור העיקרי של eCSF לפני דמה עין המקלעת 7 פיתוח.
eCSF מכיל בערך פי שלושה לא יותר חלבוןהאן המבוגר CSF, המצביע על כך שזה יכול להיות תפקיד חשוב במהלך הפיתוח 8,9. מחקרים באפרוח ועכבר להוכיח כי גורמים מופרשים בeCSF, לחץ נוזל, או שילוב של אלה, הם חשובים לנוירוגנזה, ביטוי גנים, שגשוג תאים, ותא ההישרדות בneuroepithelium 10-20. מנתח proteomic של, עכברוש אדם, עכבר, ואפרוח eCSF זיהה חלבונים רבים שעשויה להיות נחוץ לתפקוד CSF. אלה כוללים מרכיבים תאיים מטריצה, apolipoproteins, חלבוני ויסות לחץ האוסמוטי, וחלבונים מעורבים במוות של תאים והתרבות 21-24. עם זאת, הפונקציות המורכבות של eCSF אינן ידועות.
אנחנו פתחנו שיטה להסרת eCSF מחדרים במוח דג זברה, ובכך מאפשרים לזיהוי של רכיבי eCSF ולניתוח של דרישת eCSF במהלך פיתוח. למרות שיותר eCSF ניתן לאסוף מחוליות w מערכות האחרותעוברי ith גדולים, eCSF ניתן לאסוף מהשלבים המוקדמים של פיתוח דג זברה, ובתנאים גנטיים או סביבתיים המובילים למוח נורמלי נפח חלל או במורפולוגיה. הסרה ואוסף של eCSF מאפשרות ניתוח, חקירה המונית spectrometric תפקוד eCSF, וחידוש של גורמים נבחרים לתוך חדרי הלב לבדיקת תפקודם. לכן הנגישות של עובר דג הזברה מוקדם מאפשרת ניתוח מפורט של פונקצית eCSF במהלך פיתוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
השימוש בטכניקה זו באופן ידני לניקוז eCSF מחדרים במוח דג זברה יהיה שימושי לקביעת הדרישה לeCSF במהלך פיתוח. בנוסף, טכניקה זו תאפשר תיאור של פרופיל חלבון eCSF במהלך התפתחות עוברית. זיהוי של חלבונים שונים בתקופה זו יאפשר חקירה נוספת לפונקציה של CSF והתפקיד הפוטנציאלי שלה במהלך ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות נפש, והקרן הלאומית למדע. תודה מיוחדת לד"ר ג'ן Gutzman, ד"ר אמנדה דיקינסון וחברי מעבדת סייב אחרות לדיונים שימושיים רבים וביקורת בונה, ואוליבייה Paugois לגידול בעלי דגי מומחה.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Eppendorf CellTram Oil | Eppendorf | 516 000.025 |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
References
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: from development to aging. Curr. Top. Dev. Biol. 71, 1-52 (2005).
- Brown, P. D., Davies, S. L., Speake, T., Millar, I. D. Molecular mechanisms of cerebrospinal fluid production. Neurosciences. 129, 957-970 (2004).
- Praetorius, J. Water and solute secretion by the choroid plexus. Pflugers Arch. 454, 1-18 (2007).
- Speake, T., Whitwell, C., Kajita, H., Majid, A., Brown, P. D. Mechanisms of CSF secretion by the choroid plexus. Microsc. Res. Tech. 52, 49-59 (2001).
- Garcia-Lecea, M., Kondrychyn, I., Fong, S. H., Ye, Z. R., Korzh, V. In vivo analysis of choroid plexus morphogenesis in zebrafish. PLoS One. 3, e3090 (2008).
- Welss, P. Secretory activity of the inner layer of the embryonic mid-brain of the chick, as revealed by tissue culture. The Anatomical Record. 58, 299-302 (1934).
- Saunders, N. R., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M. Barrier mechanisms in the brain, II. Immature brain. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 26, 85-91 (1999).
- Zheng, W., Chodobski, A. . The blood-cerebrospinal fluid barrier. , (2005).
- Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
- Parada, C., et al. Embryonic cerebrospinal fluid collaborates with the isthmic organizer to regulate mesencephalic gene expression. J. Neurosci. Res. 82, 333-345 (2005).
- Mashayekhi, F., Salehi, Z. The importance of cerebrospinal fluid on neural cell proliferation in developing chick cerebral cortex. Eur. J. Neurol. 13, 266-272 (2006).
- Martin, C., et al. FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells. Dev. Biol. 297, 402-416 (2006).
- Martin, C., et al. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
- Gato, A., et al. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
- Desmond, M. E., Levitan, M. L., Haas, A. R. Internal luminal pressure during early chick embryonic brain growth: descriptive and empirical observations. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 285, 737-747 (2005).
- Alonso, M. I., Martin, C., Carnicero, E., Bueno, D., Gato, A. Cerebrospinal fluid control of neurogenesis induced by retinoic acid during early brain development. Dev. Dyn. 240, 1650-1659 (2011).
- Miyan, J. A., Zendah, M., Mashayekhi, F., Owen-Lynch, P. J. Cerebrospinal fluid supports viability and proliferation of cortical cells in vitro, mirroring in vivo development. Cerebrospinal Fluid Res. 3, 2 (2006).
- Mashayekhi, F., Bannister, C. M., Miyan, J. A. Failure in cell proliferation in the germinal epithelium of the HTx rats. Eur. J. Pediatr. Surg. 11, S57-S59 (2001).
- Lehtinen, M. K., et al. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
- Zappaterra, M. D., et al. A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid. J. Proteome. Res. 6, 3537-3548 (2007).
- Parvas, M., Parada, C., Bueno, D. A blood-CSF barrier function controls embryonic CSF protein composition and homeostasis during early CNS development. Dev. Biol. 321, 51-63 (2008).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome. J. Proteome Res. 4, 2420-2428 (2005).
- Gato, A., et al. Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos. J. Exp. Zool. A Comp. Exp. Biol. 301, 280-289 (2004).
- Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Res. 29, 87-90 (2001).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218 (2009).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. All-trans retinol and retinol-binding protein from embryonic cerebrospinal fluid exhibit dynamic behaviour during early central nervous system development. Neuroreport. 19, 945-950 (2008).
- Parada, C., Escola-Gil, J. C., Bueno, D. Low-density lipoproteins from embryonic cerebrospinal fluid are required for neural differentiation. J. Neurosci. Res. 86, 2674-2684 (2008).
- Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer’s vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Lowery, L. A., De Rienzo, G., Gutzman, J. H., Sive, H. Characterization and classification of zebrafish brain morphology mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
