Drenagem Manual dos Zebrafish ventrículos cerebrais embrionárias
Summary
Apresenta-se um método para recolher fluido cerebrospinal (CSF) e para criar um sistema que não tem CSF dentro do sistema ventricular embrionário do peixe-zebra cérebro. Isto permite uma análise mais aprofundada de CSF composição e sua exigência durante o desenvolvimento do cérebro embrionário.
Abstract
Líquido cefalorraquidiano (LCR) é um fluido rico em proteínas contidas dentro dos ventrículos do cérebro. Encontra-se presente durante o desenvolvimento embrionário precoce dos vertebrados e persiste durante toda a vida. Adulto CSF é pensado para amortecer o cérebro, remover resíduos, e proceder secretado 1,2 moléculas. No embrião de adultos e mais velhos, a maioria dos CSF é feita pelo plexo coróide, uma série de regiões altamente vascularizadas secretoras colocadas junto dos ventrículos do cérebro 3-5. No peixe-zebra, o plexo coróide está completamente formado a 144 horas pós-fertilização (hpf) 6. Antes disso, em embriões de vertebrados tanto peixe-zebra e outros, incluindo ratinho, uma quantidade significativa de embrionário CSF (eCSF) está presente. Estes dados e os estudos em pintainho sugerem que o neuroepitélio é secretória precoce no desenvolvimento e pode ser a fonte principal de eCSF antes do desenvolvimento do plexo coróide 7.
eCSF contém cerca de três vezes mais proteína than adulto CSF, sugerindo que pode desempenhar um papel importante durante o desenvolvimento 8,9. Os estudos realizados em pintos e de rato demonstram que os factores secretados no eCSF, a pressão do fluido, ou uma combinação destes, são importantes para a expressão do gene neurogenesis sobrevivência, a proliferação de células, e células, no neuroepitélio 10-20. Análises proteômicas de rato, humano, mouse e eCSF garota identificaram muitas proteínas que possam ser necessárias para a função LCR. Estes incluem componentes da matriz extracelular, apolipoproteínas, proteínas que regulam a pressão osmótica, e proteínas envolvidas na morte celular e proliferação 21-24. No entanto, as funções complexas do eCSF são largamente desconhecidos.
Desenvolvemos um método para a remoção de eCSF ventrículos cerebrais zebrafish, permitindo assim a identificação de componentes eCSF e para a análise do requisito eCSF durante o desenvolvimento. Embora mais eCSF podem ser coletadas de outros vertebrados sistemas wom embriões maiores, eCSF podem ser coletadas desde os primeiros estágios de desenvolvimento do peixe-zebra, e sob condições genéticas ou ambientais que levam ao volume anormal do cérebro ventrículo ou morfologia. Remoção e recolha de eCSF permite a análise de espectrometria de massa de inquérito, de função eCSF, e reintrodução de factores seleccionados para os ventrículos para ensaiar a sua função. Assim, a acessibilidade do embrião do peixe-zebra precoce permite a análise detalhada da função eCSF durante o desenvolvimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
A utilização desta técnica para drenar manualmente eCSF de ventrículos cerebrais zebrafish será útil para a determinação da exigência de eCSF durante o desenvolvimento. Além disso, esta técnica permite a descrição do perfil proteico eCSF ao longo do desenvolvimento embrionário. Identificação de proteínas diferentes durante este tempo irá permitir uma investigação mais aprofundada sobre a função do LCR e o seu papel potencial durante o desenvolvimento do cérebro. No amniotas, alguns factores identi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional para a Saúde Mental, e da National Science Foundation. Um agradecimento especial ao Dr. Jen Gutzman, Amanda Dr. Dickinson e outros membros do laboratório SIVE para muitas discussões úteis e críticas construtivas, e Olivier Paugois para criação de peixes especialista.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Eppendorf CellTram Oil | Eppendorf | 516 000.025 |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
References
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: from development to aging. Curr. Top. Dev. Biol. 71, 1-52 (2005).
- Brown, P. D., Davies, S. L., Speake, T., Millar, I. D. Molecular mechanisms of cerebrospinal fluid production. Neurosciences. 129, 957-970 (2004).
- Praetorius, J. Water and solute secretion by the choroid plexus. Pflugers Arch. 454, 1-18 (2007).
- Speake, T., Whitwell, C., Kajita, H., Majid, A., Brown, P. D. Mechanisms of CSF secretion by the choroid plexus. Microsc. Res. Tech. 52, 49-59 (2001).
- Garcia-Lecea, M., Kondrychyn, I., Fong, S. H., Ye, Z. R., Korzh, V. In vivo analysis of choroid plexus morphogenesis in zebrafish. PLoS One. 3, e3090 (2008).
- Welss, P. Secretory activity of the inner layer of the embryonic mid-brain of the chick, as revealed by tissue culture. The Anatomical Record. 58, 299-302 (1934).
- Saunders, N. R., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M. Barrier mechanisms in the brain, II. Immature brain. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 26, 85-91 (1999).
- Zheng, W., Chodobski, A. . The blood-cerebrospinal fluid barrier. , (2005).
- Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
- Parada, C., et al. Embryonic cerebrospinal fluid collaborates with the isthmic organizer to regulate mesencephalic gene expression. J. Neurosci. Res. 82, 333-345 (2005).
- Mashayekhi, F., Salehi, Z. The importance of cerebrospinal fluid on neural cell proliferation in developing chick cerebral cortex. Eur. J. Neurol. 13, 266-272 (2006).
- Martin, C., et al. FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells. Dev. Biol. 297, 402-416 (2006).
- Martin, C., et al. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
- Gato, A., et al. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
- Desmond, M. E., Levitan, M. L., Haas, A. R. Internal luminal pressure during early chick embryonic brain growth: descriptive and empirical observations. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 285, 737-747 (2005).
- Alonso, M. I., Martin, C., Carnicero, E., Bueno, D., Gato, A. Cerebrospinal fluid control of neurogenesis induced by retinoic acid during early brain development. Dev. Dyn. 240, 1650-1659 (2011).
- Miyan, J. A., Zendah, M., Mashayekhi, F., Owen-Lynch, P. J. Cerebrospinal fluid supports viability and proliferation of cortical cells in vitro, mirroring in vivo development. Cerebrospinal Fluid Res. 3, 2 (2006).
- Mashayekhi, F., Bannister, C. M., Miyan, J. A. Failure in cell proliferation in the germinal epithelium of the HTx rats. Eur. J. Pediatr. Surg. 11, S57-S59 (2001).
- Lehtinen, M. K., et al. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
- Zappaterra, M. D., et al. A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid. J. Proteome. Res. 6, 3537-3548 (2007).
- Parvas, M., Parada, C., Bueno, D. A blood-CSF barrier function controls embryonic CSF protein composition and homeostasis during early CNS development. Dev. Biol. 321, 51-63 (2008).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome. J. Proteome Res. 4, 2420-2428 (2005).
- Gato, A., et al. Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos. J. Exp. Zool. A Comp. Exp. Biol. 301, 280-289 (2004).
- Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Res. 29, 87-90 (2001).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218 (2009).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. All-trans retinol and retinol-binding protein from embryonic cerebrospinal fluid exhibit dynamic behaviour during early central nervous system development. Neuroreport. 19, 945-950 (2008).
- Parada, C., Escola-Gil, J. C., Bueno, D. Low-density lipoproteins from embryonic cerebrospinal fluid are required for neural differentiation. J. Neurosci. Res. 86, 2674-2684 (2008).
- Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer’s vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Lowery, L. A., De Rienzo, G., Gutzman, J. H., Sive, H. Characterization and classification of zebrafish brain morphology mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
