마우스 눈에 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 Subretinal 주입
Summary
이 수술 기법은 마우스 눈의 subretinal 공간으로 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 주입을 보여줍니다.
Abstract
시력의 손실이 미국에서 약 3,400,000명에 영향을 미치는 향후 몇 년간 증가 할 것으로 예상된다. 최근 1 유전자 치료와 줄기 세포 transplantations는 망막 퇴행성 질환으로 인한 실명을 치료에 키 치료 도구가되었습니다. 이러한 홍채 색소 상피 세포 이식 등 연령 관련 황반 변성에 대한 autologous 이식의 여러 형태 (AMD)는 놀라운 결과를 생성하고, 인간의 임상 실험은 유전자와 줄기 세포 요법의 다른 형태에 시작했습니다.이 이는 RPE65 유전자 교환을 포함 Leber의 선천성 amaurosis과 Stargardt의 질병에 인간 배아 줄기 (ES) 세포를 사용하여 RPE 세포 이식 환자에서 치료. 3-4 이제 유전자 치료 벡터 및 망막 질환으로 환자를 치료에 사용할 수 줄기 세포가, 그걸 확인하는 것이 중요합니다 동물 모델에서 이러한 잠재적 인 치료 전에 적용인간의 연구에서 그들을 들죠. 마우스가 눈에 유전자 치료 벡터와 줄기 세포 이식의 치료 효능을 테스트하기위한 중요한 과학적 모델이되었습니다.이 동영상을 문서에 5-8, 우리는의 subretinal 공간으로 유전자 치료 벡터 또는 줄기 세포를 주입 할 수있는 기술을 제시 마우스 눈 주변 조직의 손상을 최소화하면서.
Protocol
1. Subretinal 사출을위한 장치 조립 구입 또는 유리 모세관에서 100 μm의 직경 바늘을합니다. 이것은 셔터 P-97 pipet을 끌어 당기는 또는 이와 유사한 장비를 사용하여 수동으로 수행 할 수 있습니다. 가 원하는 직경 (100 μm)에 도달 할 때까지 모세관 튜브의 끝을 가열하여 가져온 것입니다. 작은 직경 바늘은 유전자 치료 벡터에 사용 할 수 있지만,이 셀 또는 눈에 손상없이 세포 분사에 대한 권?…
Representative Results
마우스 눈의 그림을 intravitreal와 subretinal 모두 주입 수술 절차 (화살촉, 그림 1)의 위치를 표시하는 화살표로, 참조 표시 주요 구조로 표시됩니다. 예를 lacZ lentiviral 벡터 (그림 2)와 같은 유전자 치료 벡터는 이러한 위치를 사용하여 주입 할 수 있습니다. 또한, 이러한 마우스 배아의 줄기 세포 (그림 3)과 같은 줄기 세포는 또한 마우스 눈이 사이트에 이식…
Discussion
이 비디오 기술은 성공적으로 subretinal 주입 수술 절차를 완료하고, 유전자 치료 벡터 또는 줄기 세포가 효율적으로 안과 질환을 치료하는 데 필요한 위치에 배치됩니다 있도록에 대한 지침을 제공합니다. 이것을 세포의 주변에 유전자 치료 벡터 또는 줄기 세포 유래 조직을두고 있기 때문에이 기술은, 이러한 RPE 또는 photoreceptors과 같은 망막 세포의 타겟팅 할 수 있습니다. 이전 방법은 유체가 유?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
타카유키 나가사키에서 실험 지원; 실명 방지를위한 조사이 연구는 안과 및 Visual 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 보호 정책을 준수합니다. KJW는 NIH 보조금 5T32EY013933 및 5T32DK007647-20에 의해 지원됩니다. VBM은 NIH 보조금 K08EY020530에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog | Comments |
| 0.8-1.10 x 100 mm Capillary Tube (glass) | Kimble Glass, Inc. | 34502 99 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Narishige microforge can be used instead. Catalog #MF-900 |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-25ML | Silicone |
| Dubecco’s Phosphate Buffered Saline with Calcium Chloride and Magnesium Chloride | Gibco-Invitrogen | 14040-133 | |
| Safety-Lok 25 3/4G x 12″; Blood Collection Set | B-D Vacutainer | 367298 | |
| 1 ml Sub-Q 26 5/8G Slip-Tip Syringe | Becton-Dickinson | 309597 | |
| 0.5-10 μl Finnpipette II Adjustable-Volume Pipetter | Fisherbrand | 21-377-815 | |
| 1-200 μl Natural Beveled Tips | USA Scientific, Inc. | 1111-1700 | |
| Discovery.V8 Stereo Microscope | Zeiss | MC1500 | |
| 60 mm x 15 mm Style Treated Polystyrene Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| Vannas Straight Scissors | Storz Ophthalmics | E3383 S | |
| Curved Dressing Forceps with Serrations Delicate | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| 15 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 091204 | |
| Ketamine | Ketaset III | NADA #45-290 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | NADA #139-236 | |
| Bupivacaine (Marcaine) | AstraZeneca | N/A | |
| Buprenorphine | Sigma Aldrich | B9275 |
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Citer Cet Article
Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye. J. Vis. Exp. (69), e4286, doi:10.3791/4286 (2012).