Este artículo proporciona un protocolo para el cultivo de plántulas de Arabidopsis en el RootChip, una plataforma de imágenes de microfluidos que combina el control automatizado de las condiciones de crecimiento con control microscópico y la raíz FRET basada en la medición de los niveles intracelulares de metabolitos.
Las funciones de las raíces como el ancla de la planta física y es el órgano responsable de la captación de agua y nutrientes minerales tales como los elementos nitrógeno, fósforo, sulfato y de seguimiento que las plantas adquieran en el suelo. Si queremos desarrollar enfoques sostenibles para la producción de alto rendimiento de los cultivos, tenemos que comprender mejor cómo se desarrolla la raíz, tiene un amplio espectro de nutrientes, e interactúa con organismos simbióticos y patógenos. Para lograr estas metas, tenemos que ser capaces de explorar sus raíces en detalle microscópico durante períodos de tiempo que van desde minutos a días.
Hemos desarrollado el RootChip, un polidimetilsiloxano (PDMS) – dispositivo de microfluidos basada en, lo que nos permite crecer y las raíces de las plántulas de Arabidopsis imagen, evitando cualquier tensión física a las raíces durante la preparación para la imagen 1 (Figura 1). El dispositivo contiene una estructura de canal bifurcado con válvulas de micro-mecánicos para guiar el flujo de fluidoa partir de entradas de solución a cada una de las ocho cámaras de observación 2. Este sistema de perfusión permite el microambiente raíz para ser controlado y modificado con precisión y rapidez. El volumen de las cámaras es de aproximadamente 400 nl, por lo que requieren sólo cantidades mínimas de solución de ensayo.
A continuación presentamos un protocolo detallado para el estudio de la biología de raíz en el RootChip el uso de imágenes basadas en los enfoques de la resolución en tiempo real. Las raíces pueden ser analizados a lo largo de varios días utilizando microscopía de lapso de tiempo. Las raíces pueden ser perfundidos con soluciones nutritivas o inhibidores, y hasta ocho plantas de semillero pueden ser analizados en paralelo. Este sistema tiene el potencial para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo el análisis de crecimiento de las raíces en la presencia o ausencia de productos químicos, la fluorescencia basada en el análisis de la expresión génica, y el análisis de los biosensores, por ejemplo FRET nanosensores 3.
Las principales ventajas de la RootChip sobre los métodos convencionales de crecimiento son la preparación mínimamente invasiva para la microscopía, la capacidad de alterar de forma reversible y repetidamente el entorno de las raíces, y la capacidad para la observación continua de tejido sano desarrollo competente y fisiológicamente durante un período de varios días. Anteriormente, las plántulas fueron cultivadas en medios gelificados verticalmente y se transfiere a un sistema de perfusión inmediatamente antes del experimento, que permite sólo medir raíces individuales en un momento 8. Herramientas de microfluídica se han utilizado para la Arabidopsis, pero en un nivel de integración bajo 9 o sin control de la perfusión 10. El RootChip combina un alto nivel de integración con la capacidad de automatizar el flujo de experimentos mediante la orientación precisa. Otra ventaja de esta plataforma, típico de todos los dispositivos de microfluidos 11, es que sólo cantidades mínimas de líquido se requiere para suministrar la raíz con la tuerca necesariorients, incluso para los experimentos que abarcan varios días. El RootChip está diseñado como un dispositivo de un solo uso, pero dado que los costes de producción de patatas fritas son bajas, las pequeñas cantidades de reactivos consumidos hace que el chip todavía muy rentable.
Hay algunos pasos críticos que deben ser adoptadas para garantizar la salud de las plantas de semillero:
El volumen en los conos de plástico es sólo l 3-4, que comenzará a secarse cuando se expone al aire. Por lo tanto, es fundamental que los conos se transfieren en el chip rápidamente y la humedad se mantiene alta hasta que las raíces han llegado a las cámaras de observación, que los abastecen con agua suficiente. Pasos 4.2 a 4.5 se debe realizar rápidamente y sin interrupción para evitar la desecación de las plántulas.
Pasos 3,5 – 3,8 describir la incubación de la viruta en medios líquidos durante el cual las raíces crecen en las cámaras de observación. Este paso puede ser omitido por el montaje de la viruta en la carrier inmediatamente e iniciar la perfusión constante con medio de crecimiento. Sin embargo, se recomienda sumergir en el medio de cultivo durante la noche, ya que tiene algunas ventajas: 1) Se crea un ambiente húmedo por lo que las plántulas son menos propensos a ser desecado a medida que crecen dentro de la cámara de observación, 2) el chip se sumerge en un líquido, por lo que desgasificación (paso 6,4) será más rápido.
Es importante utilizar los medios con bajas concentraciones de soluto. Soluciones más concentradas pueden precipitar y obstruir los canales, sobre todo si el chip se utiliza durante varios días.
Una vez que el dispositivo está conectado a la línea de presión de aire, el flujo de medio de cambio es controlada por la presión hidráulica en las válvulas. Para garantizar el cierre adecuado de las válvulas micromecánicos, es importante elegir una presión de control que es aproximadamente tres veces mayor que la presión del flujo. La presión de aire no debe exceder de 15 psi como el fluido será empujado fuera de las entradas de la raíz. Presiones más altas may también provocar la deslaminación del chip, que hace que el chip inutilizable.
Una limitación de la RootChip es que PDMS es poroso e hidrofóbicas. Mientras que el material es prácticamente inerte a soluciones acuosas, que pueden absorber compuestos orgánicos 12. Esto puede interferir con un intercambio rápido de soluciones como compuestos orgánicos pueden filtrarse a partir del material, incluso cuando el suministro de este compuesto se ha detenido en la entrada. Debido a la porosidad, el uso de disolventes orgánicos que pueden causar la hinchazón de la PDMS 12.
Seguimos para optimizar la RootChip y extender su utilidad, por ejemplo con las raíces de las plantas de cultivo. Creemos que mejorando el acceso a la raíz para el tratamiento y la observación, las herramientas de microfluidos, como el RootChip abrirá nuevas dimensiones de la investigación de la raíz.
The authors have nothing to disclose.
Damos las gracias a Philipp Denninger para obtener ayuda con la preparación de vídeo y Chaudhuri Bhavna para proporcionar líneas de plantas que expresan FRET sensores. Este trabajo fue apoyado por becas de la National Science Foundation (MCB 1.021.677), el Departamento de Energía (DE-FG02-04ER15542) de la WBF, los Institutos Nacionales de Salud y el Instituto Médico Howard Hughes de SRQGG fue apoyada por una larga EMBO -período de la beca. MM fue apoyado por la Fundación Alexander von Humboldt.
Items | Source | Information |
Chip carrier, software and other information. | Carnegie Institution – DPB | CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website. |
RootChip | Stanford Foundry | Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/ |
Chip controller | -home built- | The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers |