时间推移荧光成像拟南芥根系生长的根环境的快速操作使用RootChip

Summary

本文提供中的RootChip的拟南芥幼苗栽培的协议，一个微成像平台，结合微观根监测和基于FRET的细胞代谢水平的测量与自动化控制生长条件。

Abstract

作为植物的物理锚根职能和机关负责，如氮，磷，硫和微量元素，植物从土壤中获得水分和矿质营养的吸收。如果我们要发展可持续的方法来生产作物产量高，我们需要更好地了解如何根的发展，需要的营养物质很宽的频谱，共生和病原微生物的相互作用。为了实现这些目标，我们需要能够探索随着时间的推移时间从几分钟到几天不等的根在微观细节。

我们开发的RootChip，聚二甲基硅氧烷（PDMS）中-基于微流体装置，它允许我们成长，从拟南芥的形象根，同时避免任何生理上的压力，在制备过程中，根^1（ 图1）成像。该器件包含一个岔渠道结构，引导流体流动的细观阀门从解决方案入口每8个观察室^2。这灌注系统允许根微环境进行控制和修改的精度和速度。室的体积大约是400 NL，因此要求只有极少量的测试解决方案。

在这里，我们提供了一个使用实时分辨率成像为基础的方法RootChip根生物学研究的详细协议。根可超过数天使用时间的推移显微镜分析。根源可以灌注营养液抑制剂，可以并行分析多达八个幼苗。该系统具有潜在的应用范围很广，包括化学品，荧光为基础的基因表达分析，生物传感器分析存在或不存在的情况下在根系生长的分析，如共振的纳米传感器^3。

Protocol

注意：在无菌条件下执行的所有步骤的准备步骤。 1。塑料锥种子萌发的制备填写增长1％琼脂培养基厚度为5毫米，10厘米的培养皿。我们使用修改霍格兰德中等4半强度，但应选择培养基组成，以满足个人的实验要求。 虽然仍然是液体介质，使用多通道移液器，以填补从培养皿中等5μL10μL枪头。 存储在枪头中填充的提示，直到介质是固体，然后切成4毫米长的塑料锥和直立成一个Petri菜含有固体培养基中进行。 2。种子萌发和幼苗生长的影响在5分钟的5％次氯酸钠表面消毒种子，用无菌水冲洗三次，然后将其放在一个单一的种子中充满锥顶第密封微孔胶带（3M）和存储的菜，在4°C至同步萌发。 三天后，转让板块增长内阁开始发芽。我们的生长条件是23°在16H高light/8h暗周期℃（光照强度：100μE米-2 S -1）。 5至7天发芽后，幼苗应该转移到RootChip准备。在这个时候，根尖应该是附近的塑料锥体底孔。在解剖显微镜下检查健康幼苗，根长，如果适用的话，表达了荧光标记。 标记转移到芯片上的个别幼苗。选择十个左右的情况下一个苗在传输过程中被损坏。 3。幼苗转移到RootChip 消毒长期实验RootChip，包纸巾，在玻璃培养皿的地方，反应釜等设备。 一旦冷却RootChip，包括液体培养基中。完全沉浸在RootChip应，但液面应不超过3毫米以上RootChip表面。 与20μL移液器，拉根入口和室内插座通过媒介来填充介质的观察室。 选择在步骤2.5到RootChip入口的插头塑料筒。锥体应紧贴在进气口。由于RootChip装上一层薄薄的光学玻璃，不要施加太大的压力芯片。 在液体培养基中过夜孵育RootChip。为了防止浮动，在芯片上放置两个玻璃片。添加一个磁搅拌棒和关闭的菜。 大会转移到磁力搅拌器轻轻搅动介质。 该RootChip的入口在30°角相交通道设备正常FACIlitate根系生长，进入通道（ 图1A）。为了进一步支持增长所需的方向，稍微倾斜大会，网点芯片对面一侧玻片放置在培养皿上。 为了保持光/暗周期，照亮苗用环形灯（光强度：100μE米-2 S -1），连接到一个计时器。 4。连接的RootChip向承运人翌日，填补液体培养基中（ 图1B）一个密封pressurizable的小瓶。 反转芯片载体，将其放置在一个稳定的表面。从液体介质RootChip删除和插入它的PDMS侧底部的芯片载体光圈。东方芯片，使含有控制层入口的一侧正面临载体侧壁的压力线在管接头一侧。 干上的玻璃盖芯片的底部，用纸巾轻轻印迹。承运人的RootChip固定用胶带和权利的整体组装。 管接头是由灵活的塑料微孔管（TYGON 0.20“内径x 0.060”外径）的切成5厘米长的块，并把它们连接到不锈钢微孔管（新英格兰小管，0.025“外径×0.013”编号×0.75“水长）。填写水使用注射器和芯片上相应的控制层入口插头每个油管接头油管接头。稍后将填补控制层通道和用于发射微机械阀门的压力。 堵塞线到媒体/溶液小瓶（S）的两端。施加压力的溶液与空气的注射器小瓶。溶液小瓶内增加空气压力，将迫使该行的液体。 5。安装在显微镜的RootChip 将载体上的microscOPE阶段。为了减少装配了由于在房间的振动实验的过程中转移的可能性，承运人应符合完全进入的阶段插入槽口。 由气压控制芯片的芯片阀门，并通过流动的介质。两行与监管机构的分支的主要压力线 – 一个用来控制通过介质流动的渠道，与其他连接到驱动控制层的推阀的电磁空气阀。从计算机通过USB阀门控制器（拉斐尔·戈麦斯舍贝里，劳伦斯伯克利国家实验室开发的），电磁阀的操作。之前关闭两个压力调节器连接芯片。 承运人水库添加几毫升的水，保持湿度在大会高。这一步应重复了较长的实验过程中保持干燥的植物。保持较低的音量，尽量减少ţ他量的液体，可以洒在显微镜上。长期的实验，从芯片插座流出可以通过连接芯片网点，微孔管（见第4.4步）水库引导承运人的水库。另外，流出的芯片表面上的积累，可以收集吸取。 准备从透明的塑料板保护（C线）的平方表。透明塑料双面胶带固定载体，以保持高湿度大会。 定位在芯片的环形灯，并保持在光/暗周期。环形灯应关闭任何实验，使用荧光标记物，直接光照会干扰图像采集开始前。 6。使用LabVIEW接口操作RootChip LabVIEW软件平台的RootChip控制器接口下载我们网站http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip 。 芯片上的阀门关闭，施加压力，控制层，在这种情况下，通过开放的电磁空气阀。控制器的接口，可以通过点击下面的按钮阀门数量阀门驱动。明亮的绿色表示应用程序的压力，一个芯片上的截止阀（ 图2B）。激活开放前压力调节器的所有三个控制器接口解决方案进水阀。注：控制器接口设有一个反馈回路，从而使系统的状态监测。控制器界面中点击“回读”按钮，此功能可能会被激活。 打开控制层的压力调节器和最初设置为15磅，然后打开流层中的稳压器，并初步设定为5磅。依赖丁所需的流量，压力可能会有所调整。 打开进水阀的选择生长介质冲洗介质商会。 检查在显微镜下的流动路径。通常情况下，空气中被困在流通渠道，必须拆除。此外，控制层的渠道仍然含有空气，必须逼出来的水从管接头（死胡同填充）所取代。这两项任务是实现由每八腔冲洗几次（5磅），直到所有的空气从被迫到的PDMS通道（“脱气”）。注：编程控制器接口，可自动化实验。这些例程也可用于到德加芯片。 7。代表结果的RootChip的主要目的是结合的高集成度的成像平台和灌注系统在一个单一的设备。为了证明操纵我们的根微刷新暗食用色素（1:4在水耕介质稀释）商会和测量流体在商会的交流。在推荐的5磅的压力，我们测得的约1.5μL/分钟（ 图3）计算出的流量在10秒内充分交换。 我们还观察到幼苗根系生长，在这个生长在黑暗中，并与10 mM葡萄糖作为外部能量源（ 图4）提供的情况。根据介质的光组成的，如生长条件，植物可以观察在RootChip长达三天。 该RootChip已经被用来监测细胞内的葡萄糖和半乳糖水平表达基因编码的纳米传感器的根源，根据福斯特共振能量转移（FRET）5-7。在芯片的根部灌注与葡萄糖或半乳糖溶液的方形脉冲（ <strong图5）。细胞内糖的水平进行监测和显示在这里表示，作为承兑人荧光黄水晶的强度比捐助ECFP强度。中的比例上升，表明糖分积累。 图1。 RootChip原则 。 该RootChip设有八个根系的生长和成像观察室。先发芽的种子，塑料锥 – 从塑料枪头制作 – 这是与固体介质填充。根尖生长中期和到达室连续流动的液体培养基中保持在室内恒定的条件。 （红色）的细观阀门控制流量。该芯片安装在光学玻璃盖。 图未按比例。 （改编格罗斯曼等人，2011年植物细胞的权限。） SCH电磁辐射与膜片（红色）pressurizable溶液小瓶。 图2。连接安装RootChip。 安装在倒置显微镜完全的连接RootChip和载体的顶视图。 计划说明系统的阀门和控制器接口。设置引导流体流动的一个单腔阀的例子所示。虽然阀门4至8单阀，阀门0至3组行为的行为。有了这个系统，通过激活一个阀门的组合可以解决个别室。 图3。在观察CH交换的解决方案琥珀。交换使用染料溶液中观察室的流体可视化。图像是一个明亮的领域和假彩色染料的信号强度的叠加。 图4。葡萄糖/半乳糖在20H当然纳米传感器芯片上的根系生长。观察一个生长根表达了荧光共振。时间格式：HH：MM，比例尺：100微米。 图5。测量细胞内的血糖水平，使用共振的纳米传感器。 量传感器显示为，茶晶内根尖强度（左）。细胞内的反应共振纳米传感器的葡萄糖或半乳糖溶液中的应用比例的图像显示。 （改编格罗斯曼等人的许可。，2011解放军NT细胞）比例尺：100微米。 跟踪共振葡萄糖三个重复的方形脉冲（绿色）和半乳糖（红色）的响应比的变化。

Discussion

的RootChip比传统的增长方式的主要优点是显微镜微创准备，可逆性和反复改变根环境的能力，和发展主管和生理健康组织的几天内连续观测的能力。此前，幼苗生长垂直上胶凝媒体和立即转移到灌注系统实验前，只允许测量单根时间^8。微流控工具，已被用于拟南芥，但一体化水平低⁹或无灌注控制^10。 RootChip结合的高集成度，能够自动通过精确的流量指导实验。这个平台上，所有^11个微流体装置的特点，另一个优点是，只有极少量的液体需要提供必要的螺母根rients，甚至跨越数天的实验。 RootChip是目前设计为一个单一用途的设备，但因为芯片的生产成本低，消耗试剂少量使得芯片仍然很合算。

有一个必须采取的几个关键步骤，以保证幼苗的健康：

在塑料锥体的体积只有3-4微升，这将开始干燥时，暴露在空气中。因此它是至关重要的锥体转移到芯片快速和湿度保持高直到根部已经达到了观察室，这将提供足够的水。应迅速执行，并没有中断，以防止幼苗干燥步骤4.2至4.5。

3.5 – 3.8的步骤描述了芯片的液体介质，在此期间，根增长到观察室孵化。这一步可以跳过安装到C芯片arrier立即开始生长介质常数灌注。但是，我们建议在生长培养基浸泡过夜，因为它具有一些优点：1），它创建了一个潮湿的环境，使幼苗不太可能成为干，因为他们成长到观察室; 2）芯片被浸泡在液体中，所以脱气（步骤6.4）会更快。

重要的是要使用低溶质浓度媒体。较为集中的解决方案可能会沉淀，堵塞通道，特别是如果该芯片使用数天。

一旦设备连接到空气压线，流动的介质，通过改变阀门液压控制。为了保证适当的微机械阀门关闭，重要的是选择一个控制压力是比流压力高三倍左右。流压力应不超过15磅，根入口的流体将被推迟。较高的压力，马y也引起脱层的芯片，使芯片无法使用。

是硅橡胶是多孔性和疏水性的RootChip限制。虽然水溶液几乎是惰性材料，它可吸收有机物^12。这可能会干扰有机化合物可能泄漏甚至当这种化合物的供应已经停止在进口材料的解决方案的快速交换。由于孔隙率，使用有机溶剂可能引起肿胀的PDMS ^12。

我们将继续，优化的RootChip和作物根系，延长它的效用，例如。我们相信，通过改善获得治疗和观察根，像的RootChip微工具将打开根研究的新维度。

Materials

Items	Source	Information
Chip carrier, software and other information.	Carnegie Institution – DPB	CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website.
RootChip	Stanford Foundry	Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/
Chip controller	-home built-	The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers