הקלטה תאית סימולטני של Motoneuron מותנה והחיל הופק על ידי יחידת המנוע שלה בעכבר למבוגרים<em> בחי</em
Summary
שיטה חדשה זו מאפשרת הקלטה התאית סימולטני של motoneuron אחת מבוגר עכבר והמדידה של הכח הנוצר על ידי סיבי השריר שלה. החקירה בשילוב של תכונות החשמליות ומכאניות של יחידות מוטוריות בבעלי חיים רגילים ועבר שינוי הגנטי היא פריצת דרך בחקר מערכת התוקפת.
Abstract
Motoneuron השדרה כבר זמן רב מערכת מודל טובה ללימוד תפקוד עצבי כי זה תא עצב של מערכת העצבים המרכזית עם המאפיינים הייחודיים של (1) יש מטרות לזיהוי בקלות (את סיבי שריר) ויש לו פונקציה מאוד ידועה ולכן (כדי לשלוט בכיווץ שריר), (2) להיות היעד המתכנס של רשתות רבות בעמוד שדרה ויורדות, ומכאן שמו של "מסלול משותף סופי"; ו (3) שסומא גדול המאפשר לחדור אליהם עם אלקטרודות התאית החדה . יתר על כן, כאשר למדו בvivo, ניתן לרשום את הפעילות החשמלית של תאי עצב האחראים ולכח שפותח על ידי מטרותיהם שרירים בו זמנית. ביצוע הקלטות תאיות של תאי עצב אחראים in vivo לכן לשים experimentalist בעמדה הייחודית של להיות מסוגל ללמוד, באותו הזמן, את כל המדורים של "יחידת המנוע" (השם שניתן לmotoneuron, האקסון שלו, וסיבי השריר זה innervates 1): את התשומות שולטו בmotoneuron, את המאפיינים של אלקטרו motoneuron, ואת ההשפעה של מאפיינים אלה על התפקוד הפיזיולוגי של תאי עצב האחראים, כלומר את הכח הנוצר על ידי יחידת המנוע שלה. עם זאת, גישה זו היא מאוד מאתגרת בגלל ההכנה לא יכולה להיות משותקת ובכך היציבות המכאנית להקלטה התאית היא מופחתת. לכן, סוג זה של ניסויים הושג רק בחתולים ובעכברים. עם זאת, המחקר של מערכות מוטוריות בעמוד שדרה יכול לעשות קפיצה אדירה אם זה היה אפשרי לביצוע ניסויים דומים בעכברים נורמלים ומהונדס גנטיים.
מסיבות טכניות, המחקר של הרשתות בעמוד השדרה בעכברים יש בעיקר מוגבל לילוד בהכנות חוץ גופייה, שבו תאי עצב האחראים ורשתות השדרה הם לא בוגרים, על תאי עצב האחראים מופרדים מהמטרות שלהם, וכשלמד בפרוסות, מוtoneurons מופרדים ממרבית התשומות שלהם. עד לאחרונה, רק כמה קבוצות הצליחו לבצע הקלטות תאיות של תאי עצב אחראים in vivo 2-4, כולל צוות שלנו שפרסם הכנה חדשה שאפשרה לנו להשיג הקלטות יציבות מאוד של תאי עצב אחראים in vivo בעכברים בוגרים 5,6. עם זאת, הקלטות אלה התקבלו בבעלי חיים משותקים, כלומר ללא האפשרות להקליט את תפוקת הכח של תאי עצב האחראים האלה. כאן אנו מציגים הארכת הכנה מקורית זה, בו הצליח להשיג הקלטות בו זמניות של את המאפיינים אלקטרופזיולוגים של תאי עצב האחראים ושל הכח שפותח על ידי יחידת המנוע שלהם. מדובר בהישג חשוב, שכן היא מאפשרת לנו לזהות את הסוגים השונים של תאי עצב אחראים המבוססים על פרופיל כוחם, ובכך חושף את תפקידם. יחד עם מודלים גנטיים מפריעים מעגלים מגזריים שדרת 7-9, או reproducting disea האנושיse 10,11, אנו מצפים בטכניקה זו כדי להיות כלי חיוני למחקר של מערכת מוטורית בעמוד שדרה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההכנה המתוארת כאן היא הראשונה שמאפשר, בעכבר הבוגר, ההקלטה תאית סימולטני של motoneuron המותני והמדידה של הכח הנוצר על ידי סיבי שריר innervated ידי האקסון שלו.
בשל גודלו הקטן של בעלי החיים, את המיומנויות הנדרשות להכנה כירורגית זה יכול להיות מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו התאפשרה הודות לתמיכה כספית מFondation pour la המשוכלל והנדירה Médicale (FRM), המלגה הבתר מילטון Safenowitz למחקר ALS (ALS אגודה), מענקי NIH NINDS NS05462 וNS034382, וANR גרנט HyperMND.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Atropine sulfate | Aguettant | ||
| Methylprenidsolone | Pfizer | Solu-Medrol | |
| Sodium pentobarbitone | Sanofi-Aventis | Pentobarbital | |
| Ketamine | |||
| Xylazine | |||
| Glucose | |||
| Plasma expander | Roger Bellon | Plasmagel | |
| Blunt scissors | FST | 14079-10 | |
| Blunt fine scissors | FST | 15025-10 | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15002-08 | |
| Fine forceps serrated | FST | 11370-32 | |
| Fine forceps serrated | FST | 11370-31 | |
| Cunningham Spinal Adaptor | Stoelting Co. | ||
| Kwik-Cast sealant | WPI | #KWIK-CAST | |
| Ventilator | CWE Inc | SAR-830/AP | |
| Capnograph | CWE Inc | μcapstar | |
| Heating blanket | Harvard Apparatus | 507221F | |
| Intracellular amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 2B | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G |
References
- Liddel, E. G. T., Sherrington, C. S. Recruitment and some other factors of reflex inhibition. Proc. R. Soc. London. B, 488-518 (1925).
- Huizar, P., Kuno, M., Miyata, Y. Electrophysiological properties of spinal motoneurones of normal and dystrophic mice. The Journal of physiology. 248, 231-246 (1975).
- Alstermark, B., Ogawa, J. In vivo recordings of bulbospinal excitation in adult mouse forelimb motoneurons. Journal of neurophysiology. 92, 1958-1962 (2004).
- Meehan, C. F., Sukiasyan, N., Zhang, M., Nielsen, J. B., Hultborn, H. Intrinsic properties of mouse lumbar motoneurons revealed by intracellular recording in vivo. Journal of neurophysiology. 103, 2599-2610 (2010).
- Manuel, M., et al. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. J. Neurosci. 29, 11246-11256 (2009).
- Iglesias, C., et al. Mixed mode oscillations in mouse spinal motoneurons arise from a low excitability state. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 5829-5840 (2011).
- Crone, S. A., Zhong, G., Harris-Warrick, R., Sharma, K. In mice lacking V2a interneurons, gait depends on speed of locomotion. J. Neurosci. 29, 7098-7109 (2009).
- Talpalar, A. E., et al. Identification of minimal neuronal networks involved in flexor-extensor alternation in the mammalian spinal cord. Neuron. 71, 1071-1084 (2011).
- Rabe, N., Gezelius, H., Vallstedt, A., Memic, F., Kullander, K. Netrin-1-dependent spinal interneuron subtypes are required for the formation of left-right alternating locomotor circuitry. J. Neurosci. 29, 15642-15649 (2009).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
- Cifuentes-Diaz, C., et al. Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse. Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).
- Simpson, D. P. Prolonged (12 hours) intravenous anesthesia in the rat. Laboratory animal science. 47, 519-523 (1997).
- Burke, R. E. Motor Unit Types – Functional Specializations in Motor Control. Trends Neurosci. 3, 255-258 (1980).
- Kerkut, G. A., Bagust, J. The isolated mammalian spinal cord. Prog. Neurobiol. 46, 1-48 (1995).
- Carp, J. S., et al. An in vitro protocol for recording from spinal motoneurons of adult rats. Journal of Neurophysiology. 100, 474-481 (2008).
- Mitra, P., Brownstone, R. M. An In Vitro Spinal Cord Slice Preparation for Recording from Lumbar Motoneurons of the Adult Mouse. Journal of Neurophysiology. , (2011).
- Husch, A., Cramer, N., Harris-Warrick, R. M. Long duration perforated patch recordings from spinal interneurons of adult mice. Journal of Neurophysiology. , (2011).
- Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system’s final pathway. J. Integr. Neurosci. 10, 243-276 (2011).
- Nakanishi, S. T., Whelan, P. J. A decerebrate adult mouse model for examining the sensorimotor control of locomotion. Journal of Neurophysiology. 107, 500-515 (2012).
- Meehan, C. F., Grondahl, L., Nielsen, J. B., Hultborn, H. Fictive locomotion in the adult decerebrate and spinal mouse in vivo. The Journal of Physiology. 590, 289-300 (2012).
