Dissezione e immunoistochimica di larvale, pupa e adulto<em> Drosophila</em> Retine

Summary

Il<em> Drosophila</emRetina> è un reticolo cristallino composto da un piccolo numero di tipi cellulari che sono generati in modo stereotipato¹. La sua riconducibilità a sofisticate analisi genetica permette lo studio di complessi programmi di sviluppo. Questo protocollo descrive le dissezioni e immunoistochimica di retina in tre distinte fasi di sviluppo, con particolare attenzione alla differenziazione dei fotorecettori.

Abstract

L'occhio composto di Drosophila melanogaster è composto da circa 750 ommatidi (occhi unità). Ogni ommatidium è composto da circa 20 cellule, inclusa la lente-secernenti coni, cellule del pigmento, una cella a setole e otto fotorecettori (PR) R1-R8 ^2. Il PRS hanno le strutture di microvillar, le rhabdomeres, che contengono pigmenti sensibili alla luce, i rodopsine (sd). Le rhabdomeres di sei PR (R1-R6) formano un trapezio e contengono Th1 ^{3 4.} Le rhabdomeres di R7 e R8 sono posizionati in tandem nel centro del trapezio e condividono lo stesso percorso della luce. R7 e R8 PR stocasticamente esprimono diverse combinazioni di Rhs in due sottotipi principali ^5: Nel sottotipo la 'p', de p RH3 R7s è accoppiato con RH5 in p R8s, mentre nel sottotipo del 'y', Rh4 in y R7s è associato RH6 in y R8S ^{6 7 8.}

Prime caratteristiche di PR e sviluppo di ommatidi inizia nella larvale eye-antennali disco immaginale, un monostrato di cellule epiteliali. Un'ondata di differenziazione spazza tutto il disco ⁹ e avvia l'assemblaggio di cellule indifferenziate in ommatidi ^10-11. La R8 'cella fondatore' è specificato prima e recluta R1-6 e poi R7 ^12-14. Successivamente, durante lo sviluppo pupale, PR differenziazione porta a vasti cambiamenti morfologici ^15, tra cui la formazione di rhabdomere, sinaptogenesi e di espressione alla fine rh.

In questo protocollo, si descrivono i metodi per dissezioni retiniche e immunoistochimica in tre periodi definiti di sviluppo della retina, che possono essere applicati per affrontare una serie di questioni concernenti la formazione della retina e percorsi di sviluppo. Qui, usiamo questi metodi per visualizzare la differenziazione graduale PR a livello di singola cellula per intero monte larvale, midpupal e adulti retine ( <sTrong> Figura 1).

Protocol

1. Introduzione In questo video, si descrivono i metodi per dissezioni retiniche e immunoistochimica in tre periodi definiti di sviluppo: il terzo instar larvali, la midpupal e la fase adulta. Anche se il nostro protocollo funziona anche per le altre fasi di pupa (per i dettagli su fasi precedenti, vedi 16), abbiamo scelto lo stadio midpupal, come è ottimale per l'imaging tutte le PR in un unico piano focale e la loro nuclei sono facilmente identificabili, che facilita la visua…

Discussion

1. Risoluzione dei problemi

Nella nostra esperienza, dissezioni richiedono una pratica (fino a diverse settimane) e sono facilitate da raggiungere una posizione comoda a mano ²¹ con appoggio i gomiti e gli avambracci sul tavolo e con le dita in contatto con il piatto dissezione. Dita In questo modo, solo il pollice, indice e medio compiere movimenti sottili.

Rimozione della lamina senza danneggiare i fotorecettori è probabilmente il passo più difficile….

Materials

			Reagent
Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4)	Sigma		Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections.
Triton-X 100	Sigma	9002-93-1	Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature.
37% formaldehyde solution	Fisher Scientific	F75P1GAL	Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice.
5% normal horse serum	Jackson Immuno Research	008-000-001	Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees.
Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647)	Invitrogen Molecular Probes	A11015 A31572 A31571	Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees.
Alexa Fluor 488 Phalloidin		A12379	Dilute 1:100 in secondary antibody solution.
Slowfade Gold Antifade reagent	Invitrogen Molecular Probes	S36936	Mounting medium. Store at -20 degrees.
Glycerol	Fisher Scientific	G31-1	For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp.
CO2			For anesthetizing adult flies.
			Equipment
Two sharp forceps (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning		Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture.
Three-well glass dissection dishes	Fisher Scientific	21-379
Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm)	Fine Science tools	26002-10	Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook.
Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1)	Fisher Scientific	12-542A
Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned)	Fisher Scientific	12-550-143
1.5 ml microcentrifuge tubes
Clear nail polish or Scotch tape
Orbital shaker	Bellco
Slide holder box	Fisher Scientific
Parafilm	Bemis	PM996
Thin paintbrush
P20 and P200 micropipettes and tips
Dissecting microscope
Small bucket with ice			For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions.