ओलिगोपेप्टाइड की गैस चरण acidities का निर्धारण
Summary
सिस्टीन युक्त ओलिगोपेप्टाइड की गैस चरण acidities के निर्धारण में वर्णित है. प्रयोगों एक ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करते हुए प्रदर्शन कर रहे हैं. पेप्टाइड्स के सापेक्ष acidities टक्कर प्रेरित पृथक्करण प्रयोगों का उपयोग करके मापा जाता है, और मात्रात्मक acidities विस्तारित सारे महाराज गतिज विधि का उपयोग निर्धारित कर रहे हैं.
Abstract
Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue located at or near the N-terminus of a helix is often more acidic than that at or near the C-terminus 1-6. Although extensive experimental studies on the acid-base properties of peptides have been carried out in the condensed phase, in particular in aqueous solutions 6-8, the results are often complicated by solvent effects 7. In fact, most of the active sites in proteins are located near the interior region where solvent effects have been minimized 9,10. In order to understand intrinsic acid-base properties of peptides and proteins, it is important to perform the studies in a solvent-free environment.
We present a method to measure the acidities of oligopeptides in the gas-phase. We use a cysteine-containing oligopeptide, Ala3CysNH2 (A3CH), as the model compound. The measurements are based on the well-established extended Cooks kinetic method (Figure 1) 11-16. The experiments are carried out using a triple-quadrupole mass spectrometer interfaced with an electrospray ionization (ESI) ion source (Figure 2). For each peptide sample, several reference acids are selected. The reference acids are structurally similar organic compounds with known gas-phase acidities. A solution of the mixture of the peptide and a reference acid is introduced into the mass spectrometer, and a gas-phase proton-bound anionic cluster of peptide-reference acid is formed. The proton-bound cluster is mass isolated and subsequently fragmented via collision-induced dissociation (CID) experiments. The resulting fragment ion abundances are analyzed using a relationship between the acidities and the cluster ion dissociation kinetics. The gas-phase acidity of the peptide is then obtained by linear regression of the thermo-kinetic plots 17,18.
The method can be applied to a variety of molecular systems, including organic compounds, amino acids and their derivatives, oligonucleotides, and oligopeptides. By comparing the gas-phase acidities measured experimentally with those values calculated for different conformers, conformational effects on the acidities can be evaluated.
Introduction
अमीनो एसिड के अवशेष का acidities संरचनाओं को प्रभावित करने वाले सबसे महत्वपूर्ण thermochemical गुण, जेट, और प्रोटीन 9,19 की तह खुलासा प्रक्रियाओं में से एक हैं. व्यक्तिगत अमीनो एसिड के अवशेष अक्सर प्रोटीन में उनके स्थान के आधार पर विभिन्न प्रभावी acidities दिखा. विशेष रूप से, सक्रिय स्थलों पर स्थित अवशेषों अक्सर प्रदर्शन काफी acidities परेशान. ऐसा ही एक उदाहरण एंजाइमों 20,21 के thioredoxin सुपर परिवार के सक्रिय साइटों में रहने सिस्टीन अवशेषों है. सक्रिय साइट सिस्टीन प्रोटीन 3-5 सामने आया में उन लोगों की तुलना में असामान्य रूप से अम्लीय है. यह पेचदार रचना असामान्य अम्लता के लिए एक महत्वपूर्ण योगदान हो सकता है कि सुझाव दिया गया है. विशेष रूप से जलीय समाधान 2,6-8 में, समाधान में किए गए पेप्टाइड्स की एसिड आधार गुण पर व्यापक प्रयोगात्मक अध्ययन कर रहे हैं. परिणाम अक्सर विलायक प्रभाव से जटिल थे7. वास्तव में, प्रोटीन में सक्रिय साइटों की सबसे विलायक प्रभाव 9,10 कम कर रहे हैं, जहां आंतरिक क्षेत्र के पास स्थित हैं.
पेप्टाइड्स और प्रोटीन की आंतरिक एसिड आधार गुणों को समझने के क्रम में, यह एक विलायक मुक्त वातावरण में अध्ययन के लिए बाहर ले जाने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ हम गैस चरण अम्लता के निर्धारण के लिए एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित विधि परिचय. दृष्टिकोण विस्तारित सारे महाराज गतिज पद्धति के रूप में जाना जाता है. इस पद्धति का सफलतापूर्वक, ऐसी गैस चरण अम्लता, प्रोटॉन आत्मीयता, धातु आयन आत्मीयता, इलेक्ट्रॉन आत्मीयता, और आयनीकरण ऊर्जा 11-15 के रूप में विभिन्न thermochemical गुण, के निर्धारण के लिए रासायनिक प्रणालियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू कर दिया गया है 22-26. हम oligo सिस्टीन-polyalanine और सिस्टीन-polyglycine पेप्टाइड्स 17,18,27 की एक श्रृंखला की गैस चरण acidities निर्धारित करने के लिए इस पद्धति को लागू किया है. इन अध्ययनों एन टर्मिनल सिस्टीन peptid बताते हैं कितों इसी सी टर्मिनल लोगों की तुलना में काफी अधिक अम्लीय हैं. पूर्व की उच्च acidities संभावना thiolate आयनों जोरदार हेलिक्स स्थूल द्विध्रुवीय के साथ बातचीत के द्वारा स्थिर है जिसमें पेचदार गठनात्मक प्रभाव के कारण हैं. क्योंकि पेप्टाइड्स के अनह्रासी और thermally अस्थायी प्रकृति के, गतिज विधि पेप्टाइड्स 28 की हद तक सही एसिड आधार thermochemical मात्रा में उत्पादन करने के लिए वर्तमान में उपलब्ध सबसे व्यावहारिक दृष्टिकोण है.
सामान्य योजना और गतिज विधि के साथ जुड़े समीकरण चित्र 1 में दिखाया जाता है. एक पेप्टाइड की गैस चरण अम्लता के निर्धारण (मुख्यालय) प्रोटॉन वाली क्लस्टर anions की एक श्रृंखला के गठन के साथ शुरू होता है, [एक • एच • एक मैं] ¯ (या [एक ¯ • एच + • एक मैं ¯] ¯), मास स्पेक्ट्रोमीटर के आयन स्रोत क्षेत्र में जहां एक ¯ और एक मैं ¯ पेप्टाइड का deprotonated रूप हैं औरक्रमशः संदर्भ एसिड,. संदर्भ एसिड जाना जाता गैस चरण acidities साथ कार्बनिक यौगिकों हैं. संदर्भ एसिड (लेकिन पेप्टाइड की है कि जरूरी समान नहीं) एक दूसरे के समान संरचना होनी चाहिए. संदर्भ एसिड के बीच संरचनाओं की समानता उनके बीच deprotonation की entropies की समानता सुनिश्चित करता है. प्रोटॉन वाली क्लस्टर anions इसी मोनोमेरिक anions उपज को टक्कर प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) प्रयोगों का उपयोग करते हुए बड़े पैमाने पर चयनित और collisionally सक्रिय और बाद में अलग कर रहे हैं, एक ¯ और एक मैं ¯, कश्मीर और कश्मीर की दर स्थिरांक मैं, क्रमशः, चित्रा 1a में दिखाया गया है. माध्यमिक fragmentations नगण्य हैं, सीआईडी टुकड़ा आयनों की बहुतायत अनुपात, [एक ¯] / [एक मैं ¯], दर स्थिरांक, कश्मीर / कश्मीर मैं का अनुपात लगभग एक उपाय का प्रतिनिधित्व करता है. कोई रिवर्स activat कर रहे हैं कि इस धारणा के तहतदोनों हदबंदी चैनलों, अनुपात शाखाओं में सीआईडी उत्पाद आयन के लिए आयन बाधाओं, एल.एन. [एक ¯] / [एक मैं ¯], रैखिक गैस चरण पेप्टाइड की अम्लता (Δ एसिड एच) और उन लोगों के लिए सहसंबद्ध किया जाएगा संदर्भ एसिड (Δ एसिड एच i), के रूप में चित्रा 1b में दिखाया गया है. इस समीकरण में, Δ एसिड एच औसत संदर्भ एसिड का औसत गैस चरण अम्लता है, Δ (Δ एस) एन्ट्रापी अवधि (संदर्भ एसिड संरचना की दृष्टि से एक दूसरे के समान हैं अगर लगातार ग्रहण किया जा सकता है) है, आर है सार्वभौमिक गैस स्थिर, और टी eff प्रणाली के प्रभावी तापमान है. प्रभावी तापमान टक्कर ऊर्जा सहित कई प्रयोगात्मक चर पर निर्भर करता है कि एक अनुभवजन्य पैरामीटर है.
गैस चरण अम्लता के मूल्य थर्मामीटरों गतिज भूखंडों के दो सेट के निर्माण से निर्धारित होता है. पहला सेट ओब हैएल.एन. की साजिश रचने के द्वारा tained ([एक ¯] / [एक मैं ¯]) Δ एसिड एच मैं के खिलाफ – Δ एसिड एच औसत, के रूप में चित्रा -4 ए में दिखाया गया है. रेखीय प्रतिगमन वाई की एक्स = 1 / आर टी eff और अवरोध की ढलानों साथ सीधे लाइनों का एक सेट निकलेगा = – [Δ एसिड एच – Δ एसिड एच औसत] / आरटी eff – Δ (Δ एस) / आर. भूखंडों के दूसरे सेट के रूप में चित्रा 4b में दिखाया इसी ढलानों के खिलाफ पहला सेट (एक्स), से उत्पन्न अवरोध (वाई) की साजिश रचने के द्वारा प्राप्त की है. Δ एसिड एच औसत और Δ (Δ एस) / आर का एक अवरोधन – रेखीय प्रतिगमन Δ एसिड एच की एक ढाल के साथ एक नई लाइन का उत्पादन. Δ एसिड एच के मूल्य तो ढलान से प्राप्त होता है और एन्ट्रापी अवधि, Δ (Δ एस) से प्राप्त की हैअवरोधन.
प्रयोगों एक electrospray ionization (ईएसआई) आयन स्रोत को interfaced एक ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करते हुए प्रदर्शन कर रहे हैं. मास स्पेक्ट्रोमीटर का एक योजनाबद्ध आरेख चित्रा 2 में दिखाया गया है. सीआईडी प्रयोगों बड़े पैमाने पर पहली quadrupole यूनिट के साथ प्रोटॉन वाली क्लस्टर anions के चयन और उन्हें चारों ओर 0.5 mTorr के दबाव में आयोजित किया जाता है, जो टक्कर चेंबर में लीक आर्गन परमाणुओं के साथ टकराव से गुजरना करने की अनुमति देकर प्रदर्शन कर रहे हैं. हदबंदी उत्पाद आयनों जन तीसरे quadrupole यूनिट के साथ विश्लेषण कर रहे हैं. सीआईडी स्पेक्ट्रा सभी संभव माध्यमिक टुकड़े को कवर करने के लिए पर्याप्त विस्तृत मी / z सीमा के साथ कई टक्कर ऊर्जा पर दर्ज हैं. सीआईडी उत्पाद आयन तीव्रता स्कैन चयनित उत्पाद आयनों पर केंद्रित है जिसमें चयनित प्रतिक्रिया निगरानी (एसआरएम) मोड में साधन की स्थापना द्वारा मापा जाता है. सीआईडी के प्रयोगों के लिए इसी, चार अलग टक्कर ऊर्जा पर प्रदर्शन कर रहे हैंक्रमश: 1.0, 1.5, 2.0, और 2.5 eV, के केंद्र के बड़े पैमाने पर ऊर्जा (ई सेमी). केंद्र के बड़े पैमाने पर ऊर्जा समीकरण का उपयोग कर की गणना है: ई सेमी = ई प्रयोगशाला [एम / (एम + एम)], ई प्रयोगशाला प्रयोगशाला फ्रेम में टक्कर ऊर्जा है, जहां मीटर आर्गन की बड़े पैमाने पर है, और एम है प्रोटॉन वाली क्लस्टर आयन के जन.
इस अनुच्छेद में, हम मॉडल यौगिक के रूप में oligopeptide आला 3 CysNH 2 (ए 3 सीएच) का उपयोग करें. सी टर्मिनस amidated है और सिस्टीन अवशेषों की thiol समूह (एसएच) अम्लीय साइट हो जाएगा. उपयुक्त संदर्भ एसिड का चयन गैस चरण अम्लता के सफल माप के लिए महत्वपूर्ण है. आदर्श संदर्भ एसिड संरचनात्मक रूप से समान हैं (एक दूसरे से) अच्छी तरह से स्थापित गैस चरण अम्लता मूल्यों के साथ कार्बनिक यौगिकों. संदर्भ एसिड पेप्टाइड्स के करीब अम्लता मूल्यों होनी चाहिए. पेप्टाइड एक 3 सीएच के लिए, छह carboxyli halogenatedग एसिड संदर्भ एसिड के रूप में चुना जाता है. छह संदर्भ एसिड chloroacetic एसिड (MCAH), bromoacetic एसिड (MBAH), difluoroacetic एसिड (DFAH), dichloroacetic एसिड (DCAH), dibromoacetic एसिड (DBAH), और trifluoroacetic (TFAH) हैं. उनमें से दो, DFAH और MBAH, प्रोटोकॉल को वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक पेप्टाइड की गैस चरण अम्लता के सफल माप काफी हद तक उपयुक्त संदर्भ एसिड के चयन पर निर्भर करता है. आदर्श संदर्भ एसिड अच्छी तरह से स्थापित गैस चरण अम्लता मूल्यों के साथ structurally समान कार्बनिक यौगिकों हैं. संद?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Mass Spectrometer | Varian | 1200 L and 320 L | |
| Chloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 402923 | |
| Bromoacetic acid | Sigma-Aldrich | B56307 | |
| Difluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 142859 | |
| Dichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | D54702 | |
| Dibromoacetic acid | Sigma-Aldrich | 242357 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 |
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