Oligopeptidlerin Gaz fazlı asitliğe belirlenmesi
Summary
Sistein içeren oligopeptidlerin gaz-fazlı asitliğe belirlenmesi açıklanmaktadır. Deneyler, bir üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi kullanılarak gerçekleştirilir. Peptidlerin göreli asitliğe çarpışma ile indüklenen ayrışma deneyleri kullanılarak ölçülür ve kantitatif asitliğe genişletilmiş Aşçılar kinetik yöntem kullanılarak belirlenir.
Abstract
Katlanmış proteinler farklı pozisyonlarda bulunan amino asit kalıntılarının çoğu asitliğe farklı derecelerde gösterirler. Örneğin, bir helezon N-ucunda veya yakınında bulunan bir sistein kalıntısı genellikle C-terminaline 1-6 ya da yakınında daha fazla asidiktir. Peptidlerin asit-baz özellikleri hakkında kapsamlı deneysel çalışmalar sulu çözeltiler 6-8 özellikle yoğunlaştırılmış aşamasında, yürütülen olmasına rağmen, sonuçlar genellikle çözücü etkisi 7 tarafından karmaşıktır. Aslında, protein aktif bölgelerin en çözücü etkisi 9,10 kısılmış iç bölümü yakınında bulunmaktadır. Peptidlerin ve proteinlerin içsel asit-baz özelliklerini anlamak için, bir solvent içermeyen bir ortamda çalışmalar yapmak için önemlidir.
Bu gaz-fazında oligopeptidlerin asitliğe ölçmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bir sistein ihtiva eden oligopeptid Ala, 3 CysNH kullanmak <sub modeli bileşiği olarak> 2 (A 3 CH). Ölçümler köklü uzatılmış Aşçılar kinetik yöntem (Şekil 1) 11-16 dayanmaktadır. Deneyler, bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) iyonu kaynağı (Şekil 2) ile ara yüzey bağlantısı bir üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi ile gerçekleştirilmektedir. Her bir peptid örneği için, birçok referans asit seçilir. Referans asitler bilinen gaz-fazı asitliğe sahip yapısal olarak benzer organik bileşiklerdir. Peptid ve bir referans asit karışımı içindeki bir çözeltisi, kütle spektrometresi içine dahil edilir ve peptid-referans asidin bir gaz fazlı proton-bağlı anyonik kümesi oluşturulur. Proton bağlı küme kitle izole ve daha sonra çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) deney ile parçalanır. Ortaya çıkan parça iyon bolluğu asitliğe ve küme iyon ayrışma kinetik arasında bir ilişki kullanılarak analiz edilmektedir. Peptidin gaz fazı asitliği sonra obtai olduğutermo-kinetik araziler 17,18 doğrusal regresyonu ile Ned.
Yöntem, organik bileşikler, amino asitler ve bunların türevleri, oligonükleotitler ve oligopeptitler gibi moleküler sistemlerin, çeşitli uygulanabilir. Farklı düzenleyicilerin için hesaplanan bu değerlere ile deneysel olarak ölçülen gaz-fazlı asitliğe karşılaştırarak, asitliğe ilgili yapısal etkileri değerlendirilebilir.
Introduction
Amino asit kalıntılarının asitliğe yapıları etkileyen en önemli özellikleri termokimyasal, reaktiflik ve protein 9,19 arasında katlama açılımı işlemler arasında bulunmaktadır. Tek tek amino asit kalıntıları, genellikle protein konumlarını bağlı olarak farklı etkin asitliğe göstermektedir. Özellikle, aktif siteler bulunan artıkları, çoğu zaman önemli ölçüde sergileyen asitliğe tedirgin. Böyle bir örnek, enzimler 20,21 tioredoksin süper-ailesinin aktif yerleri bulunan sistein kalıntısıdır. Aktif bölge sistin proteinleri 3-5 katlanmamış kıyasla alışılmadık asidiktir. Bu sarmal yapı olağandışı asitlik önemli bir katkı olabileceği öne sürülmüştür. Özellikle sulu çözeltiler 2,6-8 yılında, çözümler yürütülen peptidlerin asit-baz özellikleri hakkında kapsamlı deneysel çalışmalar vardır. Sonuçlar genellikle çözücü etkisi ile komplike edildi7. Aslında, protein, aktif siteye çözücü etkisi en aza indirilmiştir 9,10 İç bölge yakınında bulunmaktadır.
Peptidlerin ve proteinlerin içsel asit-baz özelliklerini anlamak için, bir solvent içermeyen bir ortamda çalışmaları yürütmek için önemlidir. Burada gaz-fazlı asitlik belirlenmesi için kütle spektrometri tabanlı bir yöntemi geliştirmektir. Bu yaklaşım, genişletilmiş Aşçılar kinetik yöntemi olarak adlandırılır. Bu yöntem, başarılı bir şekilde, örneğin, gaz-fazı asitliği, proton afinitesi, metal iyon afinite, elektron afinite ile bağlanır ve iyonizasyon enerjisi 11-15 gibi çeşitli termokimyasal özellikleri, belirlenmesi için kimyasal sistemleri geniş bir uygulanmış 22-26. Biz, Oligo sistein polialanin ve sistein polyglycine peptidler 17,18,27 bir dizi gaz-fazlı asitliğe belirlemek için bu yöntemi uyguladık. Bu çalışmalar, N-terminal sistein peptidi olduğunu göstermektedirES karşılık gelen C-terminal olanlardan önemli ölçüde daha fazla asidik. Birincisinin yüksek asitliğe olasılıkla tiyolat anyonu güçlü bir sarmal makro-dipol ile etkileşimi tarafından stabilize edildiği sarmal konformasyon etkilerine bağlıdır. Çünkü peptidlerin uçucu olmayan ve termal kararsız doğanın, kinetik yöntemi peptidler 28 makul doğru asit-baz termokimyasal miktarlarda üretmek için şu anda mevcut en pratik yaklaşımdır.
Genel şeması ve kinetik yöntemi ile ilişkili denklemi Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bir peptidin gaz-fazlı asit belirlenmesi (AH) proton bağlı küme anyonlar, bir dizi oluşumu ile başlar, [A • H • A i] ¯ (veya [A ¯ • H + • Bir alıstırma] ¯), kütle spektrometresi, iyon kaynağı bölgede, burada A ve A, ¯ alıstırma peptidin deprotone formları vesırasıyla referans asitleri içerir. Referans asitler bilinen gaz-fazı asitliğe sahip organik bileşiklerdir. Referans asitler (ancak, bir peptidin edilene benzer zorunlu değildir) birbirine benzer yapılara sahip olmalıdır. Referans asitler arasındaki yapıların benzerlik aralarında deprotanasyon entropileri benzerlik sağlar. Proton bağlı küme anyon karşılık gelen monomerik anyon elde etmek için çarpışma indüklenen ayrışma (CID) deneyleri kullanılarak kitle seçilir ve çarpışmalar ile aktive edilir ve daha sonra ayrışmış, A ve A, ¯ alıstırma, k ve k hız sabitleri i, sırasıyla, Şekil 1a'da gösterilen ile. İkinci fragmentasyon ihmal edilebilir düzeyde ise, CID fragmanı iyonların bolluk oranı, [A ¯] / [A i ¯], hız sabiti k / k i oranı yaklaşık bir yaklaşımı temsil eder. Hiçbir ters aktive olduğunu varsayımı altındaHer iki kanal ayrışma, oranlar dallanma CID ürün iyon iyon engeller, ln [¯] / [A i ¯], doğrusal gaz-fazlı peptid asit (Δ asit H) ve kişilerce ilişkili olacaktır referans asitleri (Δ asit H I), Şekil 1B'de gösterilmiştir. Bu denklemde, Δ asit H ort referans asitlerin ortalama gaz fazı asitliği olan, Δ (Δ S) entropi terimi (referans asitler yapısal olarak birbirine benzer ise sabit kabul edilebilir olan), R evrensel gaz sabitidir ve T eff sisteminin etkili bir şekilde sıcaklığıdır. Etkin sıcaklık çarpışma enerjisi de dahil olmak üzere bir çok deneysel değişkenlere bağlıdır, ampirik bir parametredir.
Gaz-fazlı asitlik değeri, termo-kinetik araziler iki set yapımında tarafından belirlenir. Ilk seti ob olanLN işaretlenmesiyle tained ([A ¯] / [A i ¯]) Δ asit H I karşı – Δ asit H ort, Şekil 4a'da gösterildiği. Doğrusal regresyon Y X = 1 / RT eff ve yakaladığını eteklerinde düz çizgiler bir dizi verecektir = – [Δ asit H – Δ asit H ort] / RT eff – Δ (Δ S) / R. Parsellerin ikinci seti, Şekil 4b'de gösterildiği gibi, karşılık gelen eğimli karşı ilk grubu (X) 'dan elde edilen yakalar (E) çizilmesi ile elde edilir. Δ asit H avg ve Δ (Δ S) / R bir yolunu kesmek – Doğrusal regresyon Δ asit H bir eğimle yeni bir satır üretir. Δ asit H değeri, daha sonra eğiminden elde edilir ve entropi terimi, Δ (Δ S) elde edilirkesmek.
Deneyler, bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) iyonu kaynağı ile ara-yüzeyi üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi kullanılarak gerçekleştirilir. Kütle spektrometresinin şematik diyagramı Şekil 2 de gösterilmiştir. CID deneyler ilk kuadruple kitle birimi ile proton bağlı küme anyonlar seçilmesini ve yaklaşık 0.5 mTorr basıncında tutulur çarpışma odasının içine sızan argon atomu ile çarpışmaları geçmesi için izin vererek gerçekleştirilir. Ayrışma ürün iyonları kütle üçüncü kuadrupol ünitesi ile analiz edilmiştir. CID spektrumları tüm olası ikincil parçaları kapsayacak kadar geniş m / z aralığı ile çeşitli çarpışma enerjileri kaydedilir. CID ürün iyon yoğunlukları tarama seçilen ürünün iyonları odaklı olduğu seçilen reaksiyon izleme (SRM) modunda cihaz ayarı ile ölçülür. CID deneylere tekabül, dört farklı çarpışma enerjileri gerçekleştirilirsırasıyla 1.0, 1.5, 2.0, ve 2.5 eV, merkezi-of-kütle enerji (E cm). Merkezi bölgesinin kütle enerjisi denklem kullanılarak hesaplanır: E = E cm laboratuar [m / san (M + m)], D laboratuar laboratuar çerçeve içinde çarpışma enerjisi, m argon kütlesi ve M Proton bağlı küme iyon kütlesi.
Bu yazıda, model bileşik olarak oligopeptid Ala 3 CysNH 2 (A 3 CH) kullanın. C-terminali amide edilen ve sistein tortusuna ait tiol grubu (SH), asidik sitesi olacaktır. Uygun bir referans asitlerin seçimi gaz-fazlı asitlik başarılı bir ölçüm için çok önemlidir. İdeal referans asit yapısal olarak benzer olan (birbirlerine) köklü bir gaz-fazı asidite değeri, organik bileşikler. Referans asit peptidler olduğu kadar yakın asit değerlerine sahip olmalıdır. Peptid, bir 3 CH için, altı carboxyli halojenlenmişC asitler, referans asitler olarak seçilmiştir. Altı referans asitler kloroasetik asit (MCAH), bromoasetik asit (mbah), difluoroasetik asit (DFAH), dikloroasetik asit (DCAH), dibromoacetic asit (DBAH) ve trifluoroasetik (TFAH) vardır. Bunlardan ikisi, DFAH ve mbah, protokol göstermek için kullanılacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir peptidin gaz-fazlı asit başarılı bir ölçüm büyük ölçüde uygun bir referans asitlerin seçimi dayanır. İdeal referans asitler köklü bir gaz-fazı asidite değeri olan yapısal olarak benzer bir organik bileşiklerdir. Referans asitler birbirinden yapısına benzer bir yapıya sahip olmalıdır. Bu dizi, referans asitlerin her biri için, deprotonasyon benzer bir entropi sağlayacaktır. Referans asit peptidlerin kişilerce yakın asit değerlerine sahip olmalıdır. Amidatlanmış C-terminali ile kıs…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Mass Spectrometer | Varian | 1200 L and 320 L | |
| Chloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 402923 | |
| Bromoacetic acid | Sigma-Aldrich | B56307 | |
| Difluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 142859 | |
| Dichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | D54702 | |
| Dibromoacetic acid | Sigma-Aldrich | 242357 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 |
References
- Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins. Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).
- Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide. Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).
- Takahashi, N., Creighton, T. E. On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin. Biochimie. 35 (25), 8342-8353 (1996).
- Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. Yeast thioltransferase – the active site cysteines display differential reactivity. Archives of Biochemistry and Biophysics. 282 (1), 110-115 (1990).
- Philipps, B., Glockshuber, R. Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277 (45), 43050-43057 (2002).
- Joshi, H. V., Meier, M. S. The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate. J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).
- Kortemme, T., Creighton, T. E. Ionization of cysteine residues at the termini of model α-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family. J. Mol. Biol. 253 (5), 799-812 (1995).
- Gallo, E. A., Gellman, S. H. Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between α-Helical Turn and β-Turn in a Model Depsipeptide. J. Am. Chem. Soc. 116 (25), 11560-11561 (1994).
- Honig, B., Nicholls, A. Classical electrostatics in biology and chemistry. Science. 268 (5214), 1144-1149 (1995).
- Warshel, A. Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins. Acc. Chem. Res. 14 (9), 284-290 (1981).
- Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. Thermochemical determinations by the kinetic method. Mass Spectrom. Rev. 13 (4), 287-339 (1994).
- Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. The kinetic method of making thermochemical determinations. J. Mass Spectrom. 34 (2), 85-92 (1999).
- Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides. J. Am. Chem. Soc. 115 (11), 4844-4848 (1993).
- Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers. J. Am. Chem. Soc. 118 (47), 11884-11892 (1996).
- Cooks, R. G., Wong, P. S. H. Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications. Acc. Chem. Res. 31 (7), 379-386 (1998).
- Armentrout, P. B. Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11 (5), 371-379 (2000).
- Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4. J. Phys. Chem. A. 113 (41), 10903-10912 (2009).
- Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (4), 603-614 (2010).
- Fersht, A. . Structure and mechanism in protein science. , (1999).
- Martin, J. L. Thioredoxin-a fold for all reasons. Structure. 3 (3), 245-250 (1995).
- Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 91 (3), 229-248 (2006).
- Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method. J. Mass Spectrom. 39 (9), 986-997 (2004).
- Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine. J. Phys. Chem. B. 112 (11), 3410-3419 (2008).
- Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid. J. Phys. Chem. A. 113 (24), 6666-6676 (2009).
- Zheng, X., Cooks, R. G. Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction. J. Phys. Chem. A. 106 (42), 9939-9946 (2002).
- Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids. Int. J. Mass Spectrom. 267 (1-3), 54-62 (2007).
- Tan, J. P., Ren, J. Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2), 188-194 (2007).
- Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrom. Rev. 16 (4), 201-217 (1997).
- Gutte, B. . Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. , (1995).
- Barany, G., Merrifield, R. B. Solid-phase peptide synthesis. The Peptides. 2, 1-284 (1979).
- Chan, W. C., White, P. D. . Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (2000).
