حذوفات الجينات في الجينوم على نطاق<em> العقدية الدم</em> من جانب PCR إنتاجية عالية
Summary
وقد أنشئت فعال الجينوم على نطاق طفرة جين واحد باستخدام طريقة<em> العقدية الدم</em> كما كائن النموذج. وقد حققت هذه الطريقة من خلال تقارير إتمام المشروعات الإنتاجية العالية المؤتلف والتحولات.
Abstract
ينقول الطفرات والحذف واحد الجينات طريقتان في تطبيق خروج المغلوب الجينات في الجينوم على نطاق 1،2 البكتيريا. على الرغم من الطفرات ينقول أقل مضيعة للوقت، أقل تكلفة، ولا تحتاج إلى استكمال المعلومات الجينوم، وهناك نوعان نقاط الضعف في هذه الطريقة: (1) إمكانية حدوث طفرات متباينة في مكتبة متحولة مختلطة مكافحة يختار المسوخ مع تقليل المنافسة؛ و (2) إمكانية تعطيل الجين جزئية حيث الجينات لا تفقد وظيفتها بالكامل بعد ادراج ينقول. قد أحادية الجين التحليل حذف التعويض عن العيوب المرتبطة الطفرات ينقول. لتحسين كفاءة الجينوم على نطاق حذف جين واحد، ونحن نحاول اقامة تقنية عالية الإنتاجية للالجينوم على نطاق حذف جين واحد باستخدام الدم العقدية باعتباره النموذج الحي. كل حذف الجينات في بناء S. تم تصميم الجينوم الدم لتشمل 1-KB المنبع من الجينات المستهدفة، الجين APHA-3، ترميز البروتين المقاومة الكانامايسين، و1-KB المصب من الجينات المستهدفة. ثلاث مجموعات من الاشعال F1/R1، F2/R2، وF3/R3، على التوالي، فقد تم تصميم وتجميعها في شكل لوحة 96-PCR-جيدا لالتكبير من تلك المكونات الثلاثة للحذف كل بناء. الاشعال R1 وتحتوي على 25-F3 بي بي متواليات التي هي مكملة لمناطق الجينات-3 APHA في نهاية ال 5 هم '. يتم تنفيذ A التضخيم PCR كبيرة الحجم من الجين-3 APHA مرة واحدة لخلق بنيات كل واحد حذف الجينات. في البداية تم استبعاد المروج من الجينات APHA-3 للتقليل من التأثير المحتمل للكاسيت الكاناميسين القطبية. لإنشاء بنيات حذف الجينات، يتم تنفيذ عالية الإنتاجية PCR التضخيم والتنقية في شكل لوحة 96-أيضا. وسيبذل الخطية AMPLICON PCR لكل المؤتلف حذف الجينات من خلال ردود الفعل PCR 4 عالية الدقة باستخدام البلمرة DNA. وexpon الأوليةential مرحلة نمو S. تستكمل الدم مثقف في مرق تود هيويت مع 2.5٪ يستخدم المصل الحصان المعطل لزيادة الكفاءة لتحويل PCR-المؤتلف يبني. تحت هذا الشرط، وتصل إلى 20٪ من S. يمكن أن تتحول الخلايا الدم ~ 50 نانوغرام باستخدام الحمض النووي. استنادا إلى هذا النهج، في نهاية المطاف تم الحصول على 2048 المسوخ مع احد الجينات الحذف من الجينات في 2270 S. الواردة الدم باستثناء 4 ORFs الجينات بالكامل داخل ORFs أخرى في S. الدم SK36 و 218 الجينات الأساسية المحتملة. هذه التقنية على خلق بنيات حذف الجين هو إنتاجية عالية، ويمكن أن تكون سهلة الاستخدام في الجينوم على نطاق الحذف جين واحد لأي بكتيريا التحويلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
للتقليل من الآثار المحتملة القطبية من استبدال جين واحد مع جين المضادات الحيوية المستهدفة الخارجية على الجينات المجاورة، وتتخذ خطوتين بينما التمهيدي الأولي تصميم. بالنسبة لمعظم الجينات حذف، فقد تم تصميم R1 الاشعال وF3 لحذف المنطقة الترميز من 6 BP بعد كودون بدء الغليان ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة R01DE018138 من المعاهد الوطنية للصحة (PX) وجزئيا من جامعة فرجينيا كومنولث الرئاسية بحوث برنامج الحوافز (PRIP) 144602-3 (PX). نشكر الدكاترة. ليو تشن، Yuetan ضو وانغ شياو جينغ لمساعدة في بناء المسوخ الجينوم واسعة. ونشكر أيضا مرفق الأساسية DNA في جامعة فرجينيا كومنولث لتسلسل الحمض النووي.
Materials
| Names | Company | Catalog# | Comments (optional) |
| Primer F2 | Integrated DNA Technologies | TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT |
|
| Primer R2 | ibid | CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT |
|
| Primer F2p | ibid | GATAAACCCAGCGAACCATTTGA | |
| Primer P1 | ibid | GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA | |
| Primer P2 | ibid | GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC | |
| Primer 5′ end_R1_seq | ibid | GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA | |
| Primer 5′ end_F3_seq | ibid | GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG | |
| Primer 5′ end_R1p_seq | ibid | CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC | |
| CSP | Synprep | Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH | |
| DNA Polymerase | Invitrogen | 11304-102 | Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity |
| EcoRI | New England Biolabs Inc | R0101S | Restriction enzyme |
| Agar | American Bioanalytical | AB01185 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| BHI | BD Biosciences | 237500 | Brain Heart Infusion |
| Horse serum | Fisher Scientific | SH3007403 | Horse serum |
| Km | Fisher Scientific | BP906-5 | Kanamycin |
| TH broth | BD Biosciences | 249240 | Todd Hewitt broth |
| PureLink 96 | Invitrogen | K310096 | PureLink 96 PCR purification kit |
| QIAquick | Qiagen | 28106 | QIAquick PCR purification kit |
| Filter | Corning | 431117 | 0.22 μm polystyrene filter |
| Anoxomat System | Mart Microbiology b.v. | Anoxomat Mark II | |
| Benchtop centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 | Sorvall Legend RT Plus microplate rotor |
| Gel Documentation | UVP LLC | BioDoc-It 210 | |
| Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | Isotemp |
| Labnet’s Gel XL | Labnet | E0160 | Labnet’s Gel XL |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22621408 | Microcentrifuge 5415 R |
| Multichannel pipettes | Thermo Scientfic | 4661040, 4661020 | Finnpipette F1 |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems Inc. | N805-0200 | GeneAmp PCR system 9700 |
References
- Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis. Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).
- Kobayashi, K., et al. Essential Bacillus subtilis genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).
- Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3’5″-aminoglycoside phosphotransferase type III. Gene. 23, 331-341 (1983).
- Paik, S., et al. Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis. Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).
- Lukomski, S., et al. Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization. Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, (2006).
- de Berardinis, V. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
- Rodriguez, A. M., et al. Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis. Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).
- Perry, D., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect. Immun. 32, 1295-1297 (1981).
- Pakula, R., Walczak, W. On the nature of competence of transformable streptococci. J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Xu, P., et al. Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis. Sci. Rep. 1, (2011).
